CTLA4Ig基因转染猪皮敷料对患儿Ⅱ度烧伤炎症反应的影响

目的:观察人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 immunoglobulin,CTLA4Ig)基因转染猪皮敷料在患儿Ⅱ度烧伤治疗中对炎症反应的影响。方法:抽取我院基因转染猪皮治疗急性烧伤的患儿40例作为观察组,银离子敷料治疗烧伤的患儿40例作为对照组。对比两组烧伤患儿的住院时长、发热天数,以及治疗前后的白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(NEUT%)、C-反应蛋白(CRP)、血清降钙素原(PCT)4种炎症指标的表达水平。结果:基因转染猪皮观察组患儿住院时间为(15.23±5.58)d,短于对照组的(18.85±11.47)d。观察组患儿发热天数为(3.60±2.35)d,少于对照组(P<0.05)。观察组患儿治疗后的WBC、CRP、PCT水平均低于对照组,且降低幅度均高于对照组(P<0.05)。结论:CTLA4Ig基因转染猪皮敷料治疗小儿Ⅱ度烧伤创面具有缩短发热时间、降低炎症反应的优点。

CTLA4Ig基因转染猪皮异种移植的体外实验研究

目的 探索重组腺病毒载体 (Recombinantadenovirus ,rAdv)介导CTLA4Ig基因转染猪皮异种移植免疫耐受的分子机制。方法 构建CTLA4Ig重组腺病毒载体 ,转染猪树突状细胞 (DendriticCell,DC) ,以猪表皮细胞匀浆液为刺激原 ,观察DC递呈猪表皮抗原刺激人T细胞增殖、活化及信号转导的影响 ;同时 ,以CTLA4Ig rAdv转染小鼠DC细胞 ,观察该DC膜表面分子CD40、CD80表达。结果 CTLA4Ig转染DC能显著抑制人外周血T淋巴细胞增殖能力 (P <0 .0 1)和T细胞肌醇磷脂信号系统转导活性 ,IL 2分泌亦受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ;转染CTLA4Ig的小鼠DC膜表面分子CD80表达降低 (P <0 .0 5 )。结论 腺病毒介导CTLA4Ig基因转染猪皮能诱导人外周血T淋巴细胞免疫耐受。

共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组的腺病毒载体。 方法 将CTLA4IgcDNA插入腺病毒表达质粒 ;将重组质粒与腺病毒基因组质粒共转染 2 93细胞 ,产生重组腺病毒 ;采用dot ELISA和PCR法筛选并获得CTLA4Ig阳性表达的重组腺病毒。结果 同源重组后 ,以dot ELISA法筛选到 2个 2 93细胞的CTLA4Ig蛋白阳性表达空斑 ,PCR证实为含CTLA4Ig基因和腺病毒基因的重组体AdvCTLA4Ig。结论 本研究构建了CTLA4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA4Ig 。

CTLA4Ig基因表达对鼠皮肤移植免疫抑制作用的研究

目的 探讨静脉注射CTLA4Ig腺病毒后在大鼠体内的表达和对同种异体移植皮肤存活的影响 ,以及该载体应用的安全性 ,为该基因治疗方法在抑制器官移植排斥反应的临床应用奠定基础。方法 供体SD大鼠皮肤移植前 1周 ,用腺病毒作载体将CTLA4Ig导入Wistar大鼠体内 ,用蛋白质斑点印迹实验检测血清中CTLA4Ig的表达 ,用腺病毒荧光抗体检测腺病毒在脏器的分布。同时还观测了各脏器的病理改变及移植物生存时间。结果 CTLA4Ig腺病毒在肝、脾、心、肺、肾均有明显分布 ,但实质细胞均未见严重损伤性改变。CTLA4Ig基因能在血清中的表达高峰时间一般在 7d左右 ,移植皮肤的生存显著长于对照组 (P <0 .0 5 )。结论 从静脉注射导入的CTLA4Ig基因能在大鼠体内表达并对同种移植的排斥反应有明显的抑制作用。

重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因在人源性细胞中的表达

目的 了解CTLA 4Ig重组腺病毒在不同人细胞中的转染能力及表达效率 ,为其器官转染研究及其治疗应用奠定基础。方法 用所构建的CTLA 4Ig腺病毒感染培养的HeLa细胞、人成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞 ,应用免疫组化检测CTLA 4Ig的表达情况。结果 与重组腺病毒共培养 6h使HeLa细胞获得转染 ,12h开始表达 ,36h表达达高峰 ;人成纤维细胞 8h获得转染 ,2 4h开始表达 ,6 0h后达高峰 ;人脐静脉内皮细胞 4h获得转染 ,12h开始表达 ,36h后达高峰。结论 CTLA 4Ig重组腺病毒能高效转染HeLa细胞、人成纤维细胞。

腺病毒介导CTLA4Ig基因在体外培养细胞中的表达

目的 鉴定腺病毒介导免疫调节基因CTLA4Ig在体外培养细胞中的表达能力和细胞毒性。 方法 以肾小管上皮细胞(PK 15 )、血管内皮细胞 (ECV 3 0 4)为靶细胞 ,观察感染强度为 10 0、2 0 0、40 0时CTLA4Ig重组腺病毒转染靶细胞后不同时相细胞存活百分率 ;以免疫组化以及Westernblot分别检测CTLA4Ig在细胞以及上清中的表达。 结果 转染后 2d、4d ,转染组两种细胞存活百分率与对照组相比无显著差异 ;转染后 2 4hCTLA4Ig在PK 15和ECV 3 0 4中的阳性表达率分别为 93 7%和 90 2 % ;Westernblot检测到两种细胞上清中均有CTLA4Ig表达。 结论 重组腺病毒对非包装靶细胞毒性很小 ,能够介导CTLA4Ig基因对靶细胞的高效转染 ,并使其表达分泌型CTLA4Ig ,具备了以基因治疗诱导免疫耐受的潜能 。

CTLA_4Ig抑制T细胞增殖的体外研究

目的观察 CTL A4Ig在人外周血 T细胞增殖反应中的作用。方法植物血凝素 (PHA )、脂多糖 (L PS)、金葡菌肠毒素 B(SEB)刺激 T细胞增殖 ,在加入或未加入 CTL A4Ig情况下 ,观察细胞形态并检测 3H- Td R掺入量。结果 CTL A4Ig对PHA、L PS的抑制作用呈剂量依赖关系 ;而 CTL A4Ig浓度只有高于 5μg/ m L时 ,对 SEB才有抑制作用 ,且可完全抑制。结论CTL A4Ig对 PHA、L PS、SEB刺激下的 T细胞增殖反应有明显的抑制作用 ,但反应模式不一致。

重组腺病毒介导的CTLA4Ig基因在哺乳动物体内表达的研究

目的 了解CTLA4Ig腺病毒在不同哺乳动物体内的转染能力及表达情况。方法 用所构建的CTLA4Ig腺病毒通过静脉或腹腔注射到Balb/c小鼠、Wistar大鼠、兔、小香猪、羊体内 ,应用蛋白质斑点印记检测CTLA4Ig在以上动物血清中的表达情况 ,同时还观察各动物脏器的病理改变及动物的生存情况。结果 重组腺病毒转染 7d后大鼠、小鼠血清中出现CTLA4Ig ,持续表达 2周。各动物未见异常死亡 ,各脏器未见明显病理改变。结论 CTLA4Ig重组腺病毒能够有效转染Balb/c小鼠。

CTLA4Ig诱导免疫耐受的体外研究

目的 观察CTLA4Ig在诱导人外周血T细胞免疫耐受中的作用。方法以结核菌素刺激人外周血淋巴细胞,观察不同剂量CTLA4Ig对外周血淋巴细胞增殖反应的影响;观察CTLA4Ig和CsA(环孢霉素A)对再次结核菌素刺激和非相关第三者APC细胞刺激淋巴细胞增殖反应的影响,IL-2的变化,以及外源性IL-2对免疫耐受诱导的影响。结果CT-LA4Ig抑制淋巴细胞增殖呈剂量依赖关系,20μg/ml时抑制作用最强;CTLA4Ig能诱导免疫耐受并与CsA有协同作用;外源性IL-2能抑制免疫耐受的诱导。结论CTLA4Ig能抑制淋巴细胞的增殖和IL-2的分泌释放,CTLA4Ig和CsA联合应用能更彻底抑制淋巴细胞增殖和IL-2的分泌释放,并诱导免疫耐受;外源性IL-2能逆转免疫耐受。

CTLA4Ig局部转基因对小肠移植急性排斥的治疗作用

目的:研究CTLA4Ig基因在移植小肠局部表达及其表达产物对急性排斥反应的治疗作用. 方法:建立SD→Wistar的大鼠异位小肠移植模型,并随机分为实验组(CTLA4Ig转基因组)和对照组(非转基因组). 实验组供肠移植前经肠系膜上动脉注入脂质体包裹的CTLA4Ig cDNA,术后应用免疫组织学检查移植小肠中CTLA4Ig转基因产物的表达.移植术后3,7,10 d分别获取各组的移植小肠进行组织学检查及细胞凋亡测定. 结果:经CTLA4Ig cDNA处理的小肠在移植术后可见大量的CTLA4Ig表达.对照组移植肠在术后7,10 d分别出现I, Ⅱ度急性排斥反应,同时凋亡细胞数量显著增加.实验组移植肠术后未见排斥反应的病理学证据,凋亡细胞偶见. 结论:CTLA4Ig基因可在移植小肠局部转染表达,其表达产物可防止移植术后急性排斥反应的发生.

CTLA-4Ig融合蛋白对病毒性心肌炎小鼠Foxp3+调节性T细胞的影响

目的探讨细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA-4Ig)对柯萨奇B3病毒(CVB3)病毒性心肌炎(VMC)小鼠的病死率、心肌病理改变、病毒复制和心肌组织中Foxp3+调节性T细胞(Tregs)的影响。方法 106只4～6周龄健康雄性Balb/c小鼠,体质量为12～16 g,随机分为CTLA-4Ig组16只、病毒组40只、IgG组40只及正常对照组10只,CTLA-4Ig组、病毒组和IgG组小鼠腹腔注射半数组织细胞感染量(TCID50)为10-3/L的CVB3 0.15 ml,正常对照组小鼠接种0.15 ml不含病毒的Eagle液。CTLA-4Ig组、IgG组小鼠于接种病毒后6、72 h分别注射CTLA-4Ig(0.1 mg/kg)及IgG(0.1 mg/kg)。接种病毒后第7天处死所有小鼠在光镜下观察心肌病理变化并计算心肌组织病理积分;采用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)检测心肌组织中CVB3 mRNA的表达;采用免疫组织化学法检测Foxp3分子在心肌组织中的表达,并计算Foxp3+Tregs所占浸润细胞数的百分率。结果与病毒对照组相比较,CTLA-4Ig组小鼠病死率降低(80%比50%,P<0.05),心肌组织病理积分下降(1.78±1.05比1.00±0.72,P<0.05),心肌CVB3 mRNA表达减少(3.48±2.89比0.81±1.06,P<0.05);CTLA-4Ig组小鼠心肌组织中Foxp3+Tregs所占浸润细胞数的百分率较病毒组明显增加(9.22±2.28)%比(5.42±1.59)%,(P<0.05)。结论 CTLA-4Ig可减轻VMC小鼠心肌炎症,降低心肌病毒复制及病死率,其机制可能与上调Foxp3+Tregs比、抑制T细胞活化有关。

CTLA4Ig重组腺病毒载体的构建与体外表达

目的 :构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体 ,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础。方法 :自行设计一对分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的CTLA4Ig基因上下游引物 ,以质粒PCDNA3 0 /CTLA4Ig为模板 ,通过PCR扩增获得CTLA4Ig基因全部序列。片段回收以后经BglⅡ及HindⅢ双酶切 ,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV的启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间 ,获得重组质粒pAdTrack -CTLA4Ig。通过BglⅡ /HindⅢ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后 ,将正确重组体pAdTrack -CTLA4Ig与腺病毒骨架质粒pAdEasy - 1共转化BJ5 183细菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆 ,提取质粒用脂质体介导转染 2 93细胞 ,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果 :成功构建了含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒 ,病毒滴度为 1 6 5× 10 12 PFU/L。结论 :该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达、研究CTLA4Ig的生物学活性及移植排斥、自身免疫病的基因治疗提供了一定的基础。

人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法 利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8选择压力下 ,通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA31 7细胞克隆 ,MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果 成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体 ,生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。

CTLA4Ig基因修饰的BMSCs支持CD34^+细胞扩增的实验研究

目的 通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞 (BMSCs)中的表达 ,探讨CTLA4Ig基因修饰的BMSCs支持CD34+ 细胞扩增的功能变化 ,为该基因修饰的BMSCs联合造血干细胞移植 (HSCT) ,达到预防移植物抗宿主病 (GVHD )和纠正预处理损伤的造血微环境 (HIM)积累实验依据。方法 以CTLA4Ig 重组腺病毒按感染复数 (Multiplicityofinfection ,MOI) 5 0转染BMSCs ,以RT PCR检测目的基因转录 ;免疫磁珠 (MACS)阳性选择分选骨髓CD34+ 细胞 ,流式细胞仪检测其纯度 ;通过骨髓基质细胞支持CD34+ 扩增的细胞总数及集落形成细胞数 (CFC)的变化 ,比较转染和未转染BMSCs在支持CD34+ 细胞扩增方面的差异。结果 RT PCR在转染组及转染后传两代BMSCs中检测到CTLA4Ig基因的转录 ;通过观察扩增后细胞总数及CFC数的变化 ,发现CTLA4Ig基因转染组与未转染组BMSCs支持CD34+ 细胞扩增的能力也无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 CTLA4Ig 重组腺病毒有效介导目的基因对BMSCs的转染 ,在MOI为 5

GPI-CTLA4Ig嵌合分子的构建和在CHO-dhfr^-细胞膜上的表达

目的 :研制GPI锚定修饰的新型免疫抑制分子GPI CT LA4Ig。方法 :通过将从促衰变因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与CTLA4Ig嵌合 ,获得GPI修饰的CTLA4Ig分子。将编码GPI CTLA4Ig嵌合分子的基因克隆到真核表达载体pCI dhfr中 ,并用脂质体法转染CHO dhfr 细胞 ,用氨甲喋呤 (MTX)进行筛选。重组蛋白的表达用RT PCR、ELISA、细胞免疫荧光和Westernblot进行鉴定。最后采用ProteinA亲和层析纯化。结果 :构建了GPI CTLA4Ig嵌合分子 ,并在CHO dhfr 细胞膜上稳定表达。结论 :GPI修饰的CTLA4Ig分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中 。

人CTLA4Ig腺病毒载体的构建及其生物学功能研究

目的:通过同源重组构建CTLA4Ig腺病毒载体,研究其生物学活性,并用于基因治疗诱导心脏移植耐受。方法:通过基因重组技术,将CTLA4Ig基因克隆至腺病毒穿梭质粒pCA13中。然后将该质粒与腺病毒辅助质粒同源重组,经过293细胞包装,构建CTLA4Ig腺病毒载体。用RT-PcR、SDS-PAGE及Western blot等技术,检测包装的病毒感染293细胞后CTLA4Ig蛋白的表达及分泌,通过体外实验,观察病毒感染的293细胞上清对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。通过大鼠体内实验,检测用CTLA4Ig腺病毒载体基因治疗后,CTLA4Ig在体内的表达。结果:CTLA4Ig腺病毒载体构建成功。体外实验证实,CTLA4Ig腺病毒感染的293细胞上清液,能够抑制异基因脾细胞的单向MLR。体内实验表明,经过静脉途径给予受体大鼠CTLA4Ig腺病毒载体,能够诱导移植耐受,延长心脏移植物的存活。结论:构建的CTLA4Ig腺病毒载体,体外感染293细胞能够分泌CTLA4Ig蛋白。该蛋白可抑制T细胞的活化,CTLA4Ig腺病毒载体可用于体内基因治疗诱导移植耐受。

腺病毒介导CTLA4Ig转染正常人肝细胞株的研究

目的研究腺病毒介导CTLA4Ig基因转染正常人肝细胞株L02后,CTLA4Ig在L02细胞内的表达、生物学活性以及对L02细胞生物学特性的影响。方法重组腺病毒载体Ad-CTLA4Ig-EGFP转染体外培养的正常人肝细胞株L02,观察绿色荧光在细胞内的表达情况。以免疫细胞化学、Western blot、ELISA等方法检测CTLA4Ig在L02细胞内、外的表达情况;通过绘制细胞生长曲线、检测尿素合成能力观察转染前后L02细胞的生物学特性;转染后的L02细胞与大鼠脾脏细胞共培养,通过检测脾脏细胞增殖情况评价表达CTLA4Ig的L02细胞在体外的免疫耐受活性;收集共培养体系中的大鼠脾脏细胞,再分别与正常L02细胞、HeLa细胞共培养,检测脾细胞增殖情况以评价转染后L02细胞免疫耐受的特异性。结果转染后的L02细胞可在细胞质内大量表达CTLA4Ig蛋白,并分泌至培养上清中;转染后L02细胞生长速度无明显改变(P>0.05),单个细胞尿素合成能明显升高[(0.56±0.01)pmol/d,P<0.01];转染后的L02细胞在体外可显著抑制大鼠脾脏细胞的增殖(抑制率约为36.8%,P<0.05),被抑制后的大鼠脾脏细胞在正常L02细胞刺激下增殖较低,但在HeLa细胞刺激下则可显著增殖(P<0.01)。结论Ad-CTLA4Ig-EGFP转染后的L02细胞可表达具有生物学活性的CTLA4Ig,并在体外表现出显著的具有抗原特异性的免疫抑制活性。

CTLA-4Ig治疗C57BL/6小鼠自身免疫性肝炎的实验研究

目的研究 CTL A- 4Ig在治疗 C5 7BL/ 6小鼠自身免疫性肝炎上的作用。方法通过用 C5 7BL/ 6近交系小鼠的肝特异性抗原与弗氏完全佐剂混合物免疫攻击小鼠 ,随后用 CTL A- 4Ig治疗 ,观察小鼠的临床经过、血生化、肝脏组织学改变。结果随着免疫次数的增多 ,治疗组临床经过、血生化、肝脏组织学改变逐步与正常对照组相似 ,而病理模型组与前两组有明显差异 :血生化可见天冬氨酸氨基转移酶、球蛋白显著升高 ;肝组织学检测可见炎细胞的浸润 ,肝细胞的肿胀、灶性坏死甚至广泛坏死 ;肝组织免疫荧光检测提示有大量免疫球蛋白沉着。结论 CTL A- 4Ig能有效地治疗 C5 7BL /

CTLA4Ig和CD40LIg基因修饰骨髓间充质干细胞在异种胰岛移植排斥反应中的作用

目的探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4Ig)和T细胞分化群40补体免疫球蛋白(CD40LIg)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)在异种胰岛移植排斥反应中的作用及其可能的机制。方法将SD大鼠胰岛细胞移植到Wistar糖尿病大鼠肾包膜下,建立SD-Wistar大鼠的异种胰岛移植模型,用携带CTLA4Ig和CD40LIg基因重组腺病毒感染的MSCs进行干预治疗。取造模成功的糖尿病大鼠45只,按随机数字表法分为3组(每组15只):对照组只植入胰岛细胞;单纯MSCs组植入胰岛细胞和MSCs;基因转染MSCs组植入胰岛细胞及CTLA4Ig和CD40LIg基因转染的MSCs。观察胰岛移植后糖尿病大鼠的生存情况、血糖变化和移植物病理形态学的改变,检测移植物CTLA4Ig、CD40LIg和胰岛素的表达以及胰岛移植大鼠细胞因子水平的变化。结果①糖尿病大鼠血糖在移植后2 d降至正常,对照组血糖平均在移植后8 d升高,单纯MSCs组和基因转染MSCs组血糖分别在21 d和49 d升高。②对照组、单纯MSCs组和基因转染MSCs组,移植物存活时间分别为(10.2±2.1)、(23.5±6.8)和(52.1±7.3)d,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05);移植大鼠的生存时间分别为(21.3±5.3)、(49.7±8.5)、(95.8±13.8)d,各组间比较和移植物存活时间相似(P<0.05)。③对照组TNF-α和IL-2的水平在移植后1周内均急剧上升,而IL-4和IL-10的水平较移植前显著下降(P<0.01);2个治疗组细胞因子水平的变化和对照组正好相反。④2个治疗组移植物内可见成片的胰岛细胞团,未见明显淋巴细胞浸润,基因转染MSCs组移植物内可见CTLA4Ig、CD40LIg和胰岛素的表达。结论转移CTLA4Ig和CD40LIg基因修饰MSCs可抑制异种胰岛移植排斥反应,其效果优于MSCs单独应用。

腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰骨髓间质干细胞体外抑制免疫应答的研究

目的:通过腺病毒载体介导CTLA4Ig在大鼠骨髓间质干细胞(MSC)中的表达,探讨MSC作为基因转移靶细胞的可行性和转染效率,研究其在体外对免疫应答的抑制作用。方法:构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体pad-CTLA4Ig,按照不同的感染倍率(MOI)转染大鼠MSC,用荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,流式细胞术、Western blotting等方法检测目的蛋白CTLA4Ig在MSC中的表达。将转基因MSC加入混合淋巴细胞反应(MLR)体系,观察其抑制淋巴细胞增殖的生物学效应。结果:重组腺病毒载体pAd-CTLA4Ig对MSC的最大转染率为80.7％±4.7％,转基因MSC可检测到目的蛋白的表达。基因修饰的MSC能有效抑制MLR体系中淋巴细胞的增殖,4d达到最大抑制效率51.46％;再次MLR证实这种抑制作用是供者特异性的。结论:MSC是一种较理想的基因转移靶细胞,其表达的转基因产物CTLA4Ig可在体外特异性地抑制免疫应答。