甜菜夜蛾UAP的克隆、时空表达及RNAi研究

【目的】在昆虫中,几丁质的合成对于其生长发育至关重要,虽然几丁质合成通路在真菌中的研究比较深入,但是在昆虫中,目前大多数的研究都集中在海藻糖酶和几丁质合成酶方面,而对于通路上其他基因的研究却非常少。论文旨在阐明昆虫几丁质合成通路中的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)几丁质合成酶基因和害虫存活的影响。【方法】以甜菜夜蛾5龄第1天幼虫的cDNA为模板,通过简并引物扩增出甜菜夜蛾UAP基因(SeUAP)的中间片段,然后利用特异性引物和RACE技术扩增出3'和5'race序列,拼接得到cDNA全长。随后提取甜菜夜蛾各组织和各龄期的总RNA,并通过RT—PCR方法分析SeUAP在各个组织和龄期的表达情况。最后通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射dsUAP观察其生长状况,检测RNAi的效率以及对几丁质合成通路下游基因的影响。【结果】获得全长为2 098 bp的SeUAP cDNA,编码一个491个氨基酸残基的蛋白,与双翅目昆虫致倦库蚊、埃及伊蚊、黑腹果蝇和冈比亚按蚊的UAP亲缘关系较近。该基因在表皮和卵巢中大量表达,在气管和中肠中的表达次之,在马氏管中表达微弱,在脂肪体中则基本检测不到其转录本的存在。该基因在甜菜夜蛾生长发育的各个阶段均有表达,在卵的整个阶段、L22(幼虫2龄第2天)、L31、L42、L51、P0、P5、P7以及A3这些天中的表达量较高,其余天数表达量较低,其表达的高峰主要出现在几丁质需求量较高的时期。RNAi结果表明,通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射5 ug dsRNA,导致部分甜菜夜蛾出现蛹期畸形及死亡,并出现两种畸形现象:(1)虫体腹部蛹壳已基本形成并已硬化,但头部蛹壳形成有障碍,化蛹时无法突破旧表皮;(2)虫体头部蛹壳形成正常,也能正常突破旧表皮,但蜕皮过程仅到此为止,无法正常进行下去。定量PCR结果显示SeUAP的沉默对几丁质合成酶A基因(SeCHSA)下调不明显,而对几丁质合成酶B(SeCHSB)的表达有明显下调作用。【结论】UAP可以影响几丁质合成通路的下游基因并对甜菜夜蛾幼虫-蛹的生长发育起一定作用。

聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶与甲壳素纤维共混体系的制备与性能

以甲壳素纤维为填充材料,采用自由基聚合法制备聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)/甲壳素纤维复合水凝胶,研究了甲壳素纤维在复合水凝胶中的分散程度以及该复合水凝胶的力学性能和溶胀性能。结果表明:甲壳素纤维在复合水凝胶中的分散性与其长度和含量有关。甲壳素纤维的加入可改善PNIPAAm水凝胶的力学性能,对水凝胶体系的早期溶胀速率也有一定的促进作用。

医用几丁糖大鼠亚慢性全身毒性的研究

医用几丁糖是新型医用高分子材料,通过亚慢性毒性研究评价其生物学安全性。SD大鼠40只,随机分为对照组和试验组,每周腹腔注射2次,连续13周。试验期间每周测量体重和摄食量,每日进行临床观察。试验结束进行血液学、血清生化学和30个器官组织病理组织学检查。对照组和试验组大鼠均无动物死亡,一般症状观察、摄食量、脏器比重、血液学、血液生化学、大体形态及组织结构均未见异常。试验组大鼠注射后体重短暂降低。生物学检测结果均在可接受范围内。医用几丁糖有无明显毒性反应,具有良好的生物学安全性。

小菜蛾UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆、表达及功能研究

【目的】克隆小菜蛾几丁质合成酶基因PxUAP并阐明其功能。【方法】基于小菜蛾基因组信息,利用RT-PCR克隆小菜蛾PxUAP基因的cDNA序列,并应用荧光定量PCR和RNA干扰技术分析该基因的表达模式及功能。【结果】PxUAP(GenBank登录号:OR659549)开放阅读框长度为1467 bp,预测编码488个氨基酸,蛋白分子质量为54.985 ku,理论等电点为6.12;与金凤蝶UAP(KPJ20218.1)同源蛋白亲缘关系较近,氨基酸同源性为80.33%。发育表达谱结果表明,PxUAP在小菜蛾各个发育阶段均有表达,在雄成虫期的表达量最高;组织表达谱结果表明,PxUAP在雌成虫足和翅膀的表达量最高。RNAi结果表明,与注射ds GFP对照组相比,注射ds PxUAP显著降低了靶标基因和几丁质合成酶PxCHSA基因的表达量,且PxCHSB基因在24和48 h的表达量也显著下降;注射ds PxUAP的小菜蛾大部分无法化蛹,蛹壳出现皱缩等畸形现象,并在注射后168 h全部死亡。【结论】PxUAP是小菜蛾几丁质合成酶通路中的关键调控基因,对小菜蛾生长发育起至关重要的作用。

西花蓟马几丁质合成酶UAP基因克隆及功能分析

【目的】阐明几丁质合成通路中的关键基因UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UDP N-acetylglucosamine pyrophosphorylases,UAP)对西花蓟马Frankliniella occidentalis生长发育的影响。【方法】基于西花蓟马转录组数据,克隆验证了UAP基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)全长序列,命名为FoccUAP。利用RT-qPCR方法分析FoccUAP在各个组织和不同龄期的表达情况。最后通过向西花蓟马蜕皮24 h的2龄若虫显微注射dsUAP,检测沉默效率,观察其对西花蓟马生长发育的影响。【结果】FoccUAP基因开放阅读框全长1545 bp,编码514个氨基酸,预测蛋白分子量为56.738 kDa,具有Glyco-tranf-GTA-type Super family家族的保守结构域,与等翅目、蜚蠊目、直翅目和半翅目昆虫的UAP基因亲缘关系较近。FoccUAP基因在西花蓟马各个组织都有表达,在头部和腹部相对表达量最高,触角、胸部和足相对表达量较低。该基因在虫体生长发育的各个阶段均有表达,其中2龄幼虫、蛹以及羽化后24、48、168、240 h的成虫表达量分别是1龄幼虫的1.30、2.50、1.56、2.0、2.43和2.56倍。RNAi结果表明,注射dsUAP的西花蓟马羽化率(36.3%)和注射后120 h的存活率(5.0%)均显著低于dsGFP对照组,且注射dsUAP的西花蓟马成虫出现翅膀发育不完整、胸腹部皱缩不规则等畸形现象。【结论】FoccUAP基因对西花蓟马生长发育具有重要的作用。

双酶协同降解胶体几丁质及其作用机制

建立一种几丁质酶(chitinase,ChiA)和β-N-乙酰基己糖胺酶HJ5N协同催化体系,可实现一步反应降解胶体几丁质制备N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc),探讨不同因素对双酶协同催化体系的影响和双酶协同作用机制。结果表明,双酶协同催化体系的最适反应温度为30℃,最适反应pH值为6,ChiA与HJ5N添加比(加酶量(U)计)为2∶1。在最优反应条件下以90 g/L虾壳几丁质(胶体几丁质30.3 g/L)为底物时,GlcNAc产量为17.55 mg/mL,收率达到58%。ChiA与HJ5N的协同作用机制主要表现在HJ5N可保证中间产物几丁二糖(GlcNAc)_(2)快速被转化为GlcNAc,有效解除(GlcNAc)_(2)对ChiA的抑制作用,从而实现双酶协同高效催化降解胶体几丁质制备GlcNAc。这为酶法降解胶体几丁质制备GlcNAc的工业应用提供了一种有效策略。

绿茶素及壳多糖抗肿瘤实验研究

采用武汉市职工医学院从湖北绿茶中提取的绿茶素 (TP-91 )及湖北大学生命科学院从蚕蛹中提取的壳多糖进行抗肿瘤实验研究。瘤株为小鼠 EAC。结果表明绿茶素及壳多糖对肿瘤的抑瘤率分别为 40 .3 3 %和 5 2 .1 0 % ;对外周血淋巴细胞计数分别为 8.80± 2 .41 ,8.3 0± 3 .1 8与对照组 (2 .84± 0 .61 )比较有显著差异 (P<0 .0 1 ) ;对外周血 T淋巴细胞计数分别为 2 4.2 0± 4.5 6,1 4.1 4± 4.3 7与对照组 (4.1 0± 3 .3 5 )比较有显著性差异 (P<0 .0 1 )。结果提示绿茶素及壳多糖均有抗肿瘤作用 ,显示这两种天然物质在对肿瘤防治方面有良好的发展前景。

虾壳的微生物转化和菌种的筛选

从水产品加工场长期堆放虾壳的土壤中,分离出一株能分解虾壳有较高活力的菌株。对该菌株(ST90-5)进行了形态、培养特征、生理生化特性等鉴定,此菌为放线菌(Streptomyces sp.)。这一菌株是用甲壳质为唯一碳源的筛选培养基中筛选出来,培养基成份为Na_2HPO_4、KH_2PO_4、NH_4NO_(?)、MgSO_4·7H_2O、FeSO_4·7H_2O、CaCl_2、甲壳质、微量金属盐。该菌株产酶最适条件为pH7、温度30℃、120r/min旋转摇床培养4—7天。经过发酵的培养液测定β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和β-N-乙酰氨基半乳糖苷酶的活性。

利用沿海滩涂资源 搞好壳聚糖的研制开发

本文介绍了壳聚糖在食品、化妆品、农业、纺织、造纸。