中国玉米新品种DNA指纹库建立系列研究 Ⅱ.适于玉米自交系和杂交种指纹图谱绘制的SSR核心引物的确定

本项研究利用60个玉米自交系对初选出的158个SSR引物对进行进一步筛选,综合考虑PIC值大小、扩增带型统计的难易及引物的重复性高低,确定bnlg439、bnlg125、phi053、bnlg197、phi072、bnlg238、phi126、bnlg161、bnlg240、bnlg619共10个引物对作为构建玉米自交系和杂交种指纹库的核心引物;同时提出适用于计算玉米SSR指纹图谱概率的公式:P=1/N,对自交系N=n;对杂交种,N=Cn1+Cn2。n为所用引物的等位基因数。

比较三种DNA指纹分析方法在玉米品种纯度及真伪鉴定中的应用

本项研究归纳出三种DNA指纹分析方法 ,即特征谱带法、引物组合法和核心引物组合法 ,并比较了这三种方法在玉米品种纯度及真伪鉴定中的应用价值。在玉米基因组上均匀选取 6 2对SSR引物对 6 0个玉米自交系进行分析。 6 2对SSR引物共检测到 2 38个等位基因变异 ,平均每个位点的等位基因数4 0 8个 ,平均多态性信息量 (PIC) 0 6 12 ,平均标记索引系数 (MI) 2 5 8,评估引物多态性的三个指标并不完全一致。三种方法的比较研究表明 ,特征谱带法仅在固定的材料范围内有效 ,当扩大范围后 ,原来具有特征带的样品往往不再具有特征带 ,且需要筛选大量的引物 ,效率很低 ;引物组合法通过不同引物的有限组合 ,完全可以区分全部材料 ,避免了筛选大量引物的工作 ;核心引物组合法是引物组合法的扩展 ,不同实验室通过使用固定的一套核心引物组合 ,其指纹图谱可以相互比较和整合 ,为玉米DNA指纹图谱分析的标准化奠定基础。

适合棉花品种鉴定的SSR核心引物的筛选

本研究利用来自Cotton Marker Database(CMD)数据库中的2000个引物对32份审定棉花品种基因组DNA进行了PCR扩增,筛选出26个多态性核心引物,其中11个引物被推荐为棉花品种鉴定的首选核心引物,同时提出了核心引物理论上可区分的最大品种数的计算公式:N=G1×…×Gn,理论推测结果表明:利用11个首选核心引物进行棉花品种鉴定是可行的。建立在SSR指纹数据基础上的不同组合品种(系)间聚类分析以及对25份区试品系和A品种的真实性鉴定,结果表明:所有参试品种(系)遗传基础狭窄,32份审定品种间DNA水平上的差异与品种来源的系谱分析结果基本吻合,首选核心引物不仅可以对品种(系)的真实性做出鉴定,而且对遗传距离狭窄的品种(系)具有很好的鉴别力。

130份甘蓝型油菜种质分子身份证的构建

为准确区别油菜种质,从分布于油菜19个连锁群上的463对SSR引物中,筛选出33对扩增清晰、稳定的多态性引物,并用其分析国内外130份甘蓝型油菜材料,共检测到191个等位变异,每对引物的等位变异数变幅为3～9个,平均为5.787 9;有效等位变异数(Ne)变幅为1.906 8～7.479 0,平均为4.730 7;多样性指数(He)变幅为0.773 8～2.045 1,平均为1.551 5;引物个体识别能力(DP值)变幅为0.389 2～0.862 9,平均为0.742 8;多态信息含量(PIC值)变幅为0.475 6～0.866 3,平均为0.764 0。主坐标分析表明:33对核心引物可以将供试材料明确区分,并按照遗传相似性归为3类。通过逐级筛选,最终确定7对引物(BrGMS075、Na14E08、BrAS084、CB10545、Na14G10、CN57和Ra2E04),将每对引物的扩增产物进行数字标识,构建了130份甘蓝型油菜的品种分子身份证,达到用最少的引物组合区分不同品种的目的。

基于SSR标记的甜瓜品种(系)DNA指纹图谱库的构建

【目的】建立甜瓜品种的DNA指纹图谱数据库,实现对甜瓜品种进行快速、准确的鉴定。【方法】应用SSR分子标记技术,首先利用20份具有代表性的甜瓜品种(系)筛选SSR引物,然后对105份不同甜瓜品种(系)进行指纹图谱的构建。【结果】从1 219对SSR引物中筛选出18对引物为105份材料形成了多态性的指纹图谱,其中每对引物可以检测到4—14条数目不等的多态性条带,平均为9条;多态性信息含量(PIC)平均为0.68,变化范围为0.55—0.82。105份材料间的相似系数为0.70—0.99。利用这18对SSR核心引物构建的指纹图谱库能够有效区分所有供试材料,并且为每份材料建立了一份独特的指纹图谱。【结论】SSR标记适于构建甜瓜品种(系)的DNA指纹图谱库,可为甜瓜品种鉴定提供依据。

甘蓝型油菜SSR核心引物研究

为了确定一组适用于品种纯度鉴定和遗传多样性分析的SSR核心引物,以100份具有代表性的甘蓝型油菜品种（系）为研究材料对746对SSR引物进行筛选,综合考虑PIC（平均多态信息量）值大小、引物重复性、扩增带型清晰度、连锁群分布等因素,确定44对引物为甘蓝型油菜核心引物,其中20对引物为首选核心引物,24对引物为备选核心引物。20对首选核心引物每对可检测到3~9个多态性位点,PIC值介于0.56~0.80,共检测到102个位点,分布于11个连锁群上。随机抽取1对核心引物对一个杂交组合大田制种F1纯度进行鉴定,其鉴定结果与田间自然鉴定结果一致,并可同时鉴别出来源于父本及外来的混杂单株。将44对核心引物应用于品种的系谱分析和100份品种遗传多样性聚类分析,同样得到了很好的验证结果。该套SSR核心引物适用于甘蓝型油菜品种鉴定及遗传多样性研究。

陆地棉SSR核心引物筛选及95份骨干种质的遗传多样性分析

从391对棉花SSR引物中筛选出均匀分布于棉花26条染色体的52对核心引物,对92份陆地棉和3份亚洲棉骨干种质进行多样性分析,结果表明,52对引物的等位基因数范围为2～13,平均5.7692个,多态信息含量(Polymorphism Information Contents,PIC)在0.3457～0.8800间,均值为0.7100,显示在这些位点上,供试材料的遗传变异比较丰富;聚类分析显示,在相似系数为0.73处,3份亚洲棉种质单独聚为一类,92份陆地棉种质被分为4大类群,与系谱分析结果较为吻合;在陆地棉种内,92份种质资源的相似系数在0.71～0.97之间,平均为0.84,表明陆地棉种内的遗传相似性较高,遗传基础狭窄;而广泛的亲本选配与频繁的引种,以及选育过程中未知血缘的渗入,又致使陆地棉遗传背景丰富。

玉米杂交种纯度鉴定SNP 核心引物的确定及高通量检测方案的建立

纯度是玉米种子质量的重要指标之一,尤其杂交种自交株是影响田间产量的关键因素。KASP(kompetitive allele specific PCR)技术具有高通量、低成本的优点,适用于种子纯度检测。本研究基于12套杂交种及其父母本的三联体样本及335份玉米杂交种国家审定标准样品SNP指纹,从384个SNP基础位点筛选获得60个候选位点,位点转化为KASP引物的成功率为95%。综合考虑引物双亲互补率、多态性、稳定性和分型效果等多项指标,最终确定20个引物作为玉米杂交种纯度鉴定的核心引物,能够有效鉴定99.7%供试样品纯度。对于待测样品京科968通过SNP-DNA指纹数据库查询,并选择双亲互补型引物进行纯度鉴定。在检测的110个个体中,共检出1个自交苗和2个异型株,纯度为97.3%。同时,基于纯度核心引物对批量样品检测建立高通量纯度检测方案,具有快捷、准确、高通量和低成本的特点,为政府监管和企业提供了更多纯度鉴定方案的选择。

鉴定烟草种质资源SSR核心引物筛选和验证

核心引物对遗传多样性分析、种质资源鉴定、品种纯度和真实性检测、指纹图谱构建等研究具有重要价值。本研究利用均匀分布于烟草24条染色体的278对SSR引物,对20份亲缘关系相对较远的烟草材料进行初步筛选,筛选出32对引物。再加上10份亲缘关系较近的材料,共30份烟草材料对32对引物进行复筛,最终确定14对为核心引物,并通过12份系谱已知的烟草材料进行有效性验证。利用14对核心引物对39份烟草材料进行遗传多样性聚类分析,与农艺性状聚类分析相比较,结果表明该套SSR核心引物适用于烟草种质资源鉴定和遗传多样性分析。

百棉系列棉花自交系品种(系)SSR指纹图谱构建

利用20对SSR核心引物构建了百棉系列棉花自交系品种(系)的DNA指纹图谱。20对引物分属棉花15条染色体,共检测到116个等位基因,平均5.8个;PIC值和MI值分别平均为0.718和4.384。引物组合NAU1028/NAU5104、NAU4903/NAU3110/NAU1043、NAU0905/NAU1255、NAU3839/NAU4024、NAU5104/NAU4024、NAU2121/NAU5104和NAU1043/NAU3254/NAU4024可分别将百棉1号、百棉2号、百棉13号、百棉5号、百棉011、百棉19号和百棉985与其他所有材料区分开。构建了百棉系列棉花自交系品种(系)的SSR数字指纹代码。对棉花指纹图谱构建的供试材料和核心引物进行了分析和讨论。

白菜品种的SSR指纹图谱数据库的构建

本研究利用SSR标记技术筛选出合适的核心引物，对70个白菜品种进行DNA指纹分析，构建白菜SSR指纹图谱数据库。首先从500对引物中筛选出80对具有多态性的引物，再从其中选取20对多态性高，稳定性好且均匀分布在白菜10条染色体上的核心引物进行PCR扩增，引物多态信息含量（polymorphisminformationcontent，PIC）平均为0．716，变化范围0．473～0．932，平均杂合率0．5044。经PCR电泳检测统计得到的指纹图谱进行综合分析，形成各个白菜品种的SSR指纹代码，并且采用ClusterProject对构建的指纹图谱数据进行分析整理，得到各品种的指纹模式图谱，进而分析得到20个核心引物组合可以将70个白菜品种完全分开，并最终建立了白菜品种的SSR指纹图谱数据库。本研究构建的白菜品种SSR指纹图谱数据库，为建立白菜品种特异性、一致性及纯度的鉴定技术体系提供了基础依据。

甘蓝型油菜核心SSR引物筛选及指纹图谱构建

为筛选一组适合甘蓝型油菜DNA指纹鉴定的核心SSR引物,进而构建甘蓝型油菜品种的SSR指纹图谱库,本研究采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和毛细管电泳技术,对952对甘蓝型油菜SSR引物进行筛选。采用入选的核心引物,以等位变异大小形式,构建184份甘蓝型油菜品种的指纹图谱,并对影响等位变异大小的因素进行分析。综合考虑引物多态性信息含量（PIC）、条带清晰度、重复性及染色体分布,确定47对核心引物。结果表明,47对引物检测到51个位点,平均每条染色体2.6个,PIC值介于0.2314～0.9253,平均为0.6004。等位变异大小影响因素分析结果表明,荧光基团（6-FAM、HEX、ROX和TAMRA）对等位变异的影响介于0～5 bp,不同型号DNA分析仪的系统误差介于1～4 bp。本研究筛选的核心引物多态性丰富,可用于甘蓝型油菜品种鉴定及指纹图谱构建,不同批次样品指纹图谱的整合可采用参考品种DNA进行校正。

SSR标记鉴定玉米品种真实性及纯度的研究

[目的]探讨杂交玉米及其亲本种子真实性和纯度的分子检测判读标准。[方法]以16个玉米杂交种及其双亲和202个骨干自交系为引物筛选材料,分别构建3个杂交种和3个自交系人工群体的验证试验材料,用CTAB法提取幼苗叶片DNA,选137对SSR引物进行SSR扩增及产物检测,用于玉米品种的真实性鉴定和纯度检测,并与同批移栽至大田的种植鉴定结果相比较。[结果]从137对SSR引物中筛选出了多态性信息含量(PIC值)高、扩增条带清晰和重复性好的20对一级和20对二级核心引物,用一级核心引物对杂交种人工群体进行真实性鉴定,根据一级核心引物的扩增结果,从中选取3对(phi080、umc1196、umc2084)表现较好的引物用于杂交种人工群体的纯度检测。SSR分子检测结果与田间种植鉴定结果具有高度一致性。[结论]利用SSR标记技术鉴定玉米品种真实性和纯度的方法是可行的。

棉花杂交种SSR核心引物的筛选与评价

为筛选到一套针对棉花杂交种真实性和纯度进行鉴定的核心引物,本实验以79个棉花杂交种为材料,采用分子标记技术,对已公布的2300对SSR引物通过PCR扩增,经初筛和复选,最终获得扩增条带清晰、重复性好且分辨能力强的56对核心引物。利用这56对SSR引物对生产上推广的37个棉花杂交种进行多态性验证,共检测到95个多态性位点,变幅为1～3个;161个基因型,变幅为2～3个。随机抽出10对引物,通过组合方式可以将37个品种完全区分开。对37个品种的SSR分子标记结果进行UPGMA聚类,在相似系数为0.54时,20个长江流域杂交种中有19个被划分到第一类,17个黄河流域品种中有11个被划分到第二类,较好地反映出不同棉区因育种目标的不同所产生的差异。表明该套引物有很好的代表性、实用性和有效性。

适于玉米SSR核心引物的通用PCR扩增反应程序的建立

通过研究退火温度与引物TM值之间的关系,确定玉米核心引物设计时对TM值的特殊要求,通过比较3种PCR扩增程序,确定两步法扩增作为新设计引物的统一的PCR反应程序,为基于玉米SSR核心引物构建多重PCR组合反应进行高通量的基因分型奠定了基础。

烤烟种质资源SSR核心引物的筛选及验证

为筛选到适合烤烟品种利用的核心引物,准确评价烟草种质资源遗传多样性和亲缘关系,利用5份遗传差异明显的烤烟种质对分布于烟草24条连锁群上的2317对SSR引物进行初步筛选,筛选出70对引物。再利用20份不同地理来源的烤烟种质对初筛引物进行复筛,最终确定24对核心引物。利用核心引物对20份烤烟种质进行遗传多样性分析,共得到85个多态性位点,平均PIC值为0.52,平均等位位点数为3.54。同时对这20份烤烟种质进行聚类分析和主坐标分析,验证24对核心引物的有效性。结果显示,两种研究方法结论一致,与种质亲缘关系吻合度较高。表明该SSR核心引物体系准确有效,可以适用于烤烟种质资源鉴定和遗传多样性分析。

中国35个苦荞审定品种EST-SSR指纹图谱构建与遗传多样性分析

核心引物对种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、指纹图谱构建等研究具有重要价值。本研究以35个苦荞(Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn)审定品种为材料,从91对苦荞EST-SSR引物中筛选出50对多态性引物。综合考虑引物多态性信息量(PIC)大小、鉴别力(DP),筛选出等位变异位点数在2~4,PIC值在0.60~0.78之间的6对引物(SSR9007、SSR6873、SSR7642、SSR2234、SSR6789、SSR68216)构建了供试品种的分子指纹图谱。遗传多样性聚类分析结果表明,供试品种的相似系数为0.50~0.99。当遗传相似系数为0.60时,可将供试品种分为4大类群,其中54.3%的供试品种被聚为一类,表明苦荞审定品种遗传组成差异较小,遗传基础狭窄。聚类结果表明各类群间没有明显的地域分布趋势,但能较好的反映供试品种间的亲缘关系。

适用于玉米DNA指纹库构建的SSR核心引物的重新设计与优化

为了确定出适用于玉米DNA指纹库构建的引物,对部分并不是完全符合玉米DNA指纹库构建引物筛选原则的引物进行重新设计与优化,使其基本符合核心引物设计的要求。以umc2105、umc1705和phi299852为例,下载原引物的基因组序列,利用两个常用的引物设计软件Primer Premier5.0和Oligo6.57进行引物的重新设计及评估,在Tm值、GC含量、引发效率、错误引发率、3'端G值、引物二聚体等方面对引物进行改善,结果表明,经过对原引物的重新设计和优化,新设计的引物均能清晰的扩增,扩增效果得到了明显的改善,并且均能在统一的条件下进行实验,符合了玉米DNA指纹库构建的要求。

SSR标记鉴定玉米品种亲子关系的研究

[目的]探讨杂交玉米品种亲子关系的分子检测判读标准。[方法]以16个玉米杂交种及其双亲和202个骨干自交系为引物筛选材料,分别构建2个二联体亲子鉴定盲样和2个三联体亲子鉴定盲样,用CTAB法提取幼苗叶片DNA,选137对SSR引物进行玉米品种的亲子检测。[结果]从137对SSR引物中筛选出了多态性信息含量(PIC值)高、扩增条带清晰和重复性好的20对核心引物。SSR分子检测结果与实际情况一致。[结论]利用SSR标记技术鉴定玉米品种亲子关系的方法是可行的。

山西省主推玉米杂交种纯度鉴定SSR核心引物的筛选

选用10对SSR核心引物对18份山西省玉米杂交种进行DNA指纹分析,并综合考虑多态性和杂合率,认为umc1590和umc1196这2对引物可鉴定17个品种纯度,phi402893,phi102228,phi233376,p-phi072,umc1066和phi022也可作为纯度鉴定的引物。建议采用umc1590,phi402893,phi233376,phi022这4对引物对18个杂交种纯度进行检测。