基于COX Ⅲ基因的侧耳属真菌遗传多样性分析

侧耳属真菌是具有重要经济价值的食药用真菌,对该属真菌的准确鉴定对菌种的分离纯化和提高菌株生产潜力有重要意义。其种类繁多,种群复杂,形态差异大,且常会受到环境的影响,分类鉴定不易,常会引起争议。首次将COXⅢ基因用于真菌的遗传多样性分析,侧耳属菌种经PCR扩增和测序后得到13种侧耳属真菌的COXⅢ部分序列,并使用粒子群算法得到DNA序列的二维聚类图,用PHYLIP软件构建其系统演化树,探讨侧耳属真菌的系统亲缘关系。结果表明:金顶侧耳、桃红侧耳和鲍鱼菇彼此之间以及与其他侧耳属菌种的亲缘关系较远;阿魏蘑和白阿魏蘑之间的关系十分密切;糙皮侧耳、阿魏蘑、杏鲍菇关系较近。结合其他学者的研究和形态学证据,说明COXⅢ基因可以很好地对侧耳属进行遗传多样性分析。

玉米象线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因克隆与表达分析

【目的】克隆辣根素可能的作用位点——细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ(COXⅢ)的全长cDNA,并对其进行序列分析及原核表达。【方法】在NCBI数据库中查找玉米象(Sitophilus zeamais)COXⅢ已知的部分序列,利用RT-PCR,结合RACE技术克隆获得玉米象COXⅢ全长序列;利用DNAMAN8.0、MEGA5.1、GENEDOC、Prot Param和Target P 1.1 Server等软件对该基因全长cDNA序列、系统进化关系、基本理化性质及其三维结构进行分析;将玉米象COXⅢ基因分别与载体p EASY-Blunt E1、pET28a、pET30a、p ET32a、pET42a连接,构建原核表达载体p EASY-Blunt E1-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、p ET32a-COXⅢ、pET42a-COXⅢ并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同IPTG诱导浓度、温度以及时间内诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot(WB)对表达结果进行验证。【结果】获得的玉米象COXⅢ基因全长cDNA序列开放阅读框(ORF)为792 bp,编码263个氨基酸,编码的蛋白分子质量约为30 938.1 Da,理论等电点p I 6.51,预测分子式为C1492H2154N338O362S10,不稳定系数为34.49,总平均亲水系数为0.492,为疏水的稳定蛋白。系统发育树显示玉米象与鞘翅目象鼻虫科昆虫米象进化关系最近。原核表达结果表明,该蛋白在18℃、1 mmol·L-1 IPTG诱导24 h的条件下即能实现融合蛋白的表达,可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blot印迹检测证实大肠杆菌BL21(DE3)中表达了一个分子量约为62 k D的融合蛋白。【结论】成功从玉米象昆虫克隆得到COXⅢ全长cDNA序列,并实现了其编码蛋白的原核表达,可为后续探究玉米象COXⅢ功能和异硫氰酸酯类化合物对玉米象的作用机理提供理论依据。

暗纹东方鲀线粒体COIII克隆及序列分析

克隆并测定了暗纹东方鲀线粒体基因组(m tDNA)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ(CO III)及其下游70 bp的tRNAG ly序列。CO III基因编码框包含786个核苷酸,编码262个氨基酸的蛋白质。鱼类CO III的序列组成对A+T核苷酸的偏倚程度比较低。通过暗纹东方鲀与GenBank中8个目12种鱼类的CO III序列同源性比较,显示暗纹东方鲀与这些鱼类的CO III基因具有较高的同源性。根据暗纹东方鲀与鲀目其他5种鱼的CO III基因序列所建立的进化树,与传统的分类地位相吻合。推定的tR-NA的二级结构具有典型的三叶草型结构。根据CO III序列构建的分子进化树分析,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时,应综合考虑物种遗传变异的特点。

PCR-mtDNA技术鉴别检测不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分

以鸭肌肉组织DNA为模板,利用PCR-mtDNA技术成功克隆出了鸭mtDNA COⅢ基因(GenBank Accession No.DQ655706)。对所克隆的序列分析表明,其序列包括鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ(COⅢ)基因全序列784 bp,通过同源性分析可知,动物的线粒体DNA COⅢ基因是相对保守的,利用此特性设计PCR-mtDNA方法鉴别检测鸭源性成分的特异性引物;以各种动物肌肉组织及饲料DNA为模板进行PCR扩增、经反复验证筛选出只能扩增出鸭DNA的目的片段,而不能扩增出其他动物DNA片段的特异性强、稳定性好的引物P3、P4;利用此引物PCR扩增鸭DNA的特异性片段为226 bp,对PCR产物进行测序分析可知与已克隆的鸭mtDNA COⅢ基因同源性达到100%,证明了所筛选引物的准确性。通过对不同含量的DNA模板溶液进行PCR扩增的方法,对筛选出的特异性引物P3、P4进行灵敏度试验,结果分析表明灵敏度约为0.001%,证明该PCR方法具有特异性强、灵敏度高的特点,完全可作为鉴别不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分的方法。

乙型肝炎病毒X蛋白与细胞色素c氧化酶Ⅲ的特异性结合

目的探讨HBVX蛋白与细胞色素c氧化酶Ⅲ（COXⅢ）之间的结合作用。方法采用交合实验验证HBVX蛋白和COXⅢ在酵母细胞内的结合作用，利用离体结合实验证实两者在体外的结合作用，采用免疫共沉淀实验证实两者在哺乳动物细胞中的结合作用。结果携带CoXⅢ基因的酵母与携带X基因的酵母交合后发生反应，β-半乳糖苷酶（LacZ）活性检测菌落呈现蓝色，离体结合实验Western印迹中出现特异性结合活性反应条带，提示X蛋白和COXⅢ在体外存在直接相互作用，免疫共沉淀实验在相对分子质量为17000处出现蛋白条带，提示在哺乳动物细胞水平仍能检测到X蛋白和COXⅢ的特异结合。结论COXⅢ与X蛋白在原核细胞和哺乳动物细胞中均存在特异性结合，HBV可能通过此反应干扰线粒体呼吸链功能及能量代谢过程。

乙型肝炎病毒X蛋白与细胞色素C氧化酶亚单位Ⅲ结合的定位研究

目的探索细胞色素C氧化酶亚单位Ⅲ（COXⅢ）与乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）的具体结合位点。方法构建pAS2-1-X变异体重组载体，醋酸锂转化法将其转入酵母细胞，通过PCR法及测序法证实目的片段转入酵母细胞；Westem blot法明确变异体蛋白在酵母细胞中能否正确表达，滤膜转印法排除自身激活作用；固体培养基交合实验及β-半乳糖苷酶活性实验检测HBx和COXⅢ的结合区域。结果成功构建含HBx第1～72位氨基酸的变异体重组载体pAS2-1-Xl和第1～117位氨基酸的变异体重组载体pAS2-1-X2，测序及PCR均证实片段的正确性。Western blot证实变异体蛋白在酵母细胞中可正确表达，且变异体蛋白无自身激活作用。交合实验及β-半乳糖苷酶活性检测将HBx和COXⅢ的结合区域定位于72～117位氨基酸。结论通过酵母双杂合实验证实HBx和COXⅢ的结合区域定位于72～117位氨基酸，此结合区域的明确有望帮助进一步阐明X蛋白在体内的作用机制，并可能为慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌的防治提供新思路。

基于线粒体DNA多态性鉴定烟台海鲜市场鱼种

由烟台海鲜市场随机采集具有相对重要商业价值的10种海鱼(小黄鱼、牙片、鲅鱼、面条鱼、鲐鱼、鲳鱼、鲈鱼、偏口、黑鱼、白姑鱼),利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对鱼种进行鉴定.首先提取10种海鱼的基因组DNA,利用自行设计的通用引物对其线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因(MT-co3)进行PCR扩增,对扩增产物克隆、测序,用NCBI数据库检索,确定了10种海鱼的鱼种.依据测序结果进行限制性内切酶酶切分析,选用NlaⅢ和HinfⅠ2种内切酶进行酶切,获得了各种鱼类特异的酶切片段图谱.研究结果表明,PCR-RFLP能有效地区分以上10种海鱼,在鱼种鉴定上具有简便、准确的优势,可为鱼类食品检测提供科学依据.

巨魾细胞色素氧化酶基因多态性及系统进化研究

采用PCR技术克隆得到12尾巨魾(Bagarius yarrelli)的细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)、细胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)和细胞色素氧化酶Ⅲ(COⅢ)的基因序列。结果显示:巨魾COⅠ基因序列全长1 551 bp,12个个体共出现9个单倍型,13个突变位点;COⅡ基因序列全长691 bp,12个个体共出现5个单倍型,5个突变位点;COⅢ基因序列全长784 bp,12个个体出现7个单倍型,8个突变位点。通过最小进化法Minimum Evolution(ME)构建系统发育树分析显示,巨魾与14种鮡科鱼在序列上有一定的同源性,并且COⅠ、COⅡ和COⅢ都与中华纹胸鮡(Glyptothorax sinense)、福建纹胸鮡(Glyptothorax fukiensis)、三线纹胸鮡(Glyptothorax trilineatus)和长丝黑鮡(Gagata dolichonema)在同一个分支,表明巨魾与纹胸鮡属和黑鮡属有较近的亲缘关系。

代谢综合征大鼠肝细胞线粒体损伤和mtDNA编码蛋白的表达变化

目的通过观察代谢综合征(MS)大鼠肝细胞线粒体的损伤性改变及部分线粒体基因(mtDNA)编码蛋白的表达情况,探讨线粒体结构和功能改变的可能机制及其在MS发病中的作用。方法采用经典的饮食诱导法建立喂养型MS大鼠模型。动态监测大鼠收缩压(SBP)、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的变化,确认为MS的大鼠处死后分离肝细胞。电镜观察肝细胞线粒体结构改变,并对线粒体损伤进行半定量评分;WesternBlotting方法检测mtDNA编码蛋白NADH脱氢酶1(ND1)、细胞色素c氧化酶2(COX2)和线粒体复合体Ⅲ亚单位1的含量。结果电镜结果显示,MS大鼠肝细胞线粒体肿胀,呈空泡样变,嵴减少或消失,损伤级别为3.11±0.31,对照组损伤级别为0.30±0.03,二者差异显著(P<0.01)。MS大鼠肝细胞ND1和COX2的表达较对照组明显减少(P<0.05),线粒体复合体Ⅲ亚单位1的表达较对照组明显增加(P<0.05)。结论 mtDNA编码蛋白ND1、COX2和线粒体复合体Ⅲ亚单位1的表达异常可造成线粒体呼吸链电子传递障碍,使"电子漏"增多,自由基产生过多,从而引起线粒体的结构损伤和氧化磷酸化功能障碍,最终导致物质和能量代谢紊乱,这可能是MS的发病机制之一。