克氏原螯虾Dmrt1基因克隆及表达特征分析

【目的】克隆克氏原螯虾(Procambarus clarkii)Dmrt1基因(PcDmrt1),分析其在雌性和雄性克氏原螯虾不同组织中及不同发育时期性腺中的表达特征,为研究克氏原螯虾性别分化与发育提供理论依据。【方法】克隆PcDmrt1基因开放阅读框(ORF),并对其进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR检测PcDmrt1基因在雌性和雄性克氏原螯虾不同组织及不同发育时期性腺中的表达特征。【结果】PcDmrt1基因ORF长1752 bp,共编码583个氨基酸残基。PcDmrt1蛋白分子量64.9 kD,理论等电点(pI)为9.51,包含2个DM结构域。同源比对分析表明,克氏原螯虾PcDmrt1氨基酸序列与红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)Dmrt氨基酸序列同源性最高,为61.2%。基于Dmrt氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树表明,克氏原螯虾与东澳岩龙虾(Sagmariasus verreauxi)、红螯螯虾和美洲螯龙虾(Homarus americanus)亲缘关系较近。PcDmrt1基因在克氏原螯虾性腺、肝胰腺、鳃、脑、眼柄、肌肉和肠道7个组织中均有表达,性腺中相对表达量最高,肝胰腺和眼柄次之,在其他组织中相对表达量较低,在性腺、肝胰腺和眼柄3个组织中,雌性和雄性克氏原螯虾Pcdmrt1基因相对表达量存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,下同)差异。在克氏原螯虾不同发育时期,PcDmrt1基因相对表达量在出膜后5 d出现高峰,最高表达出现在出膜后40 d,此时雄性幼虾PcDmrt1基因相对表达量极显著高于雌性幼虾。【结论】克氏原螯虾PcDmrt1蛋白含有2个DM结构域,属于典型的Dmrt家族成员,在进化上保守。PcDmrt1基因广泛表达于克氏原螯虾各组织中并在性腺中高表达,基因相对表达量在发育早期呈上升趋势,表明PcDmrt1基因可能在早期参与克氏原螯虾性别分化与组织发育。

不同物种中Dmrt1在性别发育中的功能研究

Dmrt是一个从低等动物到高等动物之间都具有高度保守性且与性别决定和分化密切相关的基因家族。尽管不同物种间性别发育的遗传控制存在差异,但Dmrt1已被广泛证实在雄性的性别决定和精巢的性腺分化及维持中行使重要功能。本文重点从Dmrt基因家族的分类和Dmrt1在不同物种性别发育中的功能研究展开了综述,以期为性别决定基因的分子调控机制和发展人工性别控制育种提供理论依据。

线纹海马Dmrt1基因的克隆与表达分析

Dmrt1广泛参与了不同物种的性别决定和性腺发育过程,为探究dmrt1在线纹海马中的分子特征及表达模式,本研究采用RACE-PCR克隆到了其cDNA全长1009 bp,包含87 bp的5’UTR、756 bp的ORF和166 bp的3’UTR,共编码251个氨基酸;氨基酸多重比对显示,线纹海马dmrt1在DM结构域内具有高度保守性;系统进化树分析表明,其与侏儒海马的dmrt1亲缘关系最近;RT-qPCR显示,dmrt1在线纹海马成体的性腺中呈显著的雄性偏好性高表达于精巢,表明其可能参与了线纹海马精巢的形成和维持。该研究为进一步深入研究线纹海马dmrt1在性别发育中的功能奠定了基础。

牙鲆dmrt1基因的克隆及其与P450arom基因的组织表达分析

通过基因组步移和3’RACE获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)dmrt1的cDNA全序列,该基因开放阅读框全长909bp,其编码的蛋白具有高度保守的DM结构域,5’UTR区含有性别相关转录因子Sox9和Sox5的结合位点。牙鲆dmrt1基因只在牙鲆的性腺中表达,且在精巢中的表达明显高于卵巢,表明牙鲆的dmrt1可能是一种性别相关基因。同时,对牙鲆的另一性别相关基因P450arom在成体各组织的表达分析结果表明,该基因除在牙鲆的性腺中有表达外,在肾脏、脾脏、鳃和脑等其他组织中也有不同程度的表达。牙鲆P450arom基因在性腺中的表达也存在两性差异,其表达模式与dmrt1的正好相反,在卵巢中的表达量明显高于精巢。

芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀CYP19A、DMRT1基因表达及性腺分化的影响

采用组织学和分子生物学方法,研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)后暗纹东方鲀(Takifugu obscures)初孵仔鱼CYP19A、DMRT1基因表达以及性腺的组织学变化,以期进一步了解P450芳香化酶(P450arom)在鱼类早期性别分化过程中的作用。RT-PCR结果显示,对照组样品CYP19A和DMRT1表达显示性二态,雌性表达CYP19A基因,雄性表达DMRT1基因。LE处理组在性别分化期间,雄性样品单一表达DMRT1,雌性样品则同时表达CYP19A和DMRT1。qRT-PCR结果显示:LE处理组雌性仔鱼CYP19A基因表达被显著抑;虽然在仔鱼出膜后22d(dph)的表达水平高于9 dph,但仅为同日对照组的2.11%。LE处理组雌性样品22 dph时DMRT1基因表达量上调,至150 dph时达对照组雄性水平。55 dph的性腺组织学结果表明,LE处理可导致暗纹东方鲀稚鱼原始卵巢退化,并向功能性精巢发育。150 dph的LE处理组性腺均为精巢,并与对照组精巢发育同步。结论认为,暗纹东方鲀性腺分化期间P450arom是卵巢形成和维持发育所必须的,抑制P450arom活性可导致雌性暗纹东方鲀发生雄性化逆转。

黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长克隆及其表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长序列,并利用实时荧光定量RT-PCR技术对该基因在黄颡鱼成体不同组织及不同发育阶段的表达情况进行研究。结果表明,黄颡鱼DMRT1基因cDNA序列全长1 381bp,其中5′端非翻译区30bp,3′端非翻译区454bp[不包括poly(A)],开放阅读框885bp,编码295个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,黄颡鱼DMRT1基因与革胡子鲶同源性最高(为81%),与黑鲷、虹鳟、斑马鱼、青鳉的同源性分别为60%、59%、64%和52%,与小鼠、人的同源性较低,分别为42%和44%。实时荧光定量RT-PCR分析表明:DMRT1基因在黄颡鱼胚胎发育阶段及胚后发育的1～51d仔鱼均有表达,且在胚后发育的第31天表达量最高;在成体,只在雄性精巢中特异性表达,其他组织均无表达,且性腺发育阶段的Ⅳ期精巢表达量最高,表明该基因可能在黄颡鱼雄性性腺的形成或功能维持上具有重要作用。

雌激素对中华鳖性腺分化及DMRT1、SOX9基因表达的影响

中华鳖(Pelodiscus sinensis)性别决定的方式一直存在较大的争议,分子机制更是不清楚。在大部分脊椎动物中,雌激素在性别决定和性腺分化中扮演重要的调控作用。实验通过对性别分化前胚胎进行雌二醇(E2)和芳香化酶抑制剂(AI)处理,研究雌激素在中华鳖性腺分化中的作用及机理。实验结果显示,与对照组(雌性比例49%)相比,E2处理组中雌性中华鳖仔鳖比例显著增加,高达92.3%;而在AI处理组中,雌性比例显著下调至13.1%。HE染色分析表明,ZZ(雄性)和ZW(雌性)胚胎分别经过E2和AI处理后,ZZ和ZW性腺结构呈现明显的雌性化和雄性化特征。同时,通过RT-PCR和免疫荧光染色发现,E2能显著降低雄性性别关键因子DMRT1和SOX9 mRNA和蛋白表达水平;AI则表现相反的调节作用。综上所述,雌激素通过抑制雄性性别关键因子DMRT1和SOX9的表达来抑制雄性分化,促进雌性分化,揭示雌激素在中华鳖雌性性别分化中起着重要的调控作用。

黑鲷DMRT1基因cDNA的克隆、组织表达谱及在性别逆转前后性腺中的表达

利用RT PCR和 3′ RACE的方法从黑鲷精巢中克隆了DMRT1基因cDNA的部分序列。组织特异性表达分析表明DMRT1基因只在精巢中表达。半定量RT PCR检测显示DMRT1基因在性别逆转前、性别逆转期和性别逆转后的精巢中的表达量无显著差异。在鱼类成体的精巢中 ,DMRT1的表达量可能不会因精巢结构或生理状态的改变而发生改变 。

胡子鲇Dmrt1基因全长cDNA克隆及其表达分析

以胡子鲇(Clarias fuscus)为研究对象,利用RT-PCR技术和SMART RACE技术克隆获得Dmrt1基因cDNA全长,并利用生物信息学分析其结构及功能;利用半定量RT-PCR技术检测胡子鲇性腺(精巢/卵巢)、肌肉、肠、肝脏、心脏、头肾、鳃丝、脑和眼等10种组织以及Ⅱ—Ⅴ期精巢中Dmrt1基因表达。结果表明:胡子鲇Dmrt1基因cDNA全长为1417 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)为35 bp,3′非编码区(3′-UTR)为516 bp,开放阅读框(ORF)包含864 bp,编码287个氨基酸(aa),预测所编码DMRT1为主要位于细胞核内的不稳定性亲水蛋白。氨基酸序列比对显示,胡子鲇DMRT1与已公布的非洲胡子鲇、蟾胡子鲇、黄颡鱼等鲇形目鱼类的相似性为83.3%—96.1%。胡子鲇DMRT1中具有DMRT基因家族共有的、保守性很高的DM结构域,此结构域具有典型的"C2H2C4"锌指结构,与上述鲇形目鱼类的相似性达100%,与斑马鱼、青鳉、虹鳟等鱼类的相似性为91.9%—97.3%,而与鸡、鼠、猪人等的相似性达80%以上。组织表达显示,胡子鲇Dmrt1基因仅在精巢中表达,且Ⅱ期精巢(即精子发生期)中Dmrt1基因表达量显著高于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期精巢(P<0.05),而卵巢及其他8种组织中均无表达,表明Dmrt1是胡子鲇精巢特异性表达基因,可能与胡子鲇的雄性性别决定、精子发生及精巢发育密切相关。

鸡DMRT1基因CRISPR/Cas9载体构建及打靶效率的检测

DMRT1(Double sex and Mab-3 related transcription factor 1)是鸡性腺分化和发育的关键候选基因,其详细的功能和作用途径还未被阐明。为了解明DMRT1在鸡性腺分化和发育过程中的功能,研究首次利用在线sg RNA平台设计4条鸡DMRT1 sg RNA序列,构建了4个sg RNA表达载体:Guide-1、Guide-2、Guide-3和Guide-4。转染鸡DF-1成纤维细胞后,利用T7E1内切酶的方法检测4个表达载体的打靶效率。结果显示,成功构建了4条正确的鸡DMRT1 sg RNA表达载体,并且都能高效地在DF-1细胞中表达,其中Guide-4表达载体能有效地打靶DMRT1基因,打靶效率为24.82%。研究结果为进一步在鸡胚敲除DMRT1基因,研究其功能奠定了基础。

半滑舌鳎Dmrt1α基因的cDNA克隆及其表达

在脊椎动物中,许多基因参与了性腺的分化和性别的决定过程,Doublesex and mab-3-related transcription factor1（Dmrt1）编码了一个具有DM框的转录因子,在哺乳类、鸟类、两栖类、爬行类和鱼类中与雄性性腺的分化和形成有关,是一种目前已知从无脊椎动物到人最保守的性别分化相关基因。半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是近年来新开发的一种理想的增养殖对象,雌性个体生长速度比雄性快2-3倍,为了探索半滑舌鳎的性别决定机理,培育全雌苗种,实现单性养殖,本研究采用同源克隆策略,从半滑舌鳎精巢中获得Dmrt1α cDNA全长1149bp,其中包含777bp的开放阅读框（ORF）,45bp长的5’末端非编码区（UTR）,327bp长的3’末端UTR。氨基酸序列分析表明半滑舌鳎与其他鱼类Dmrt1基因的氨基酸序列同源性为41.9%-58.1%,与鼠和人的Dmrt1氨基酸序列同源性较低,只有32.6%和33.7%。RT-PCR分析表明,Dmrt1α只在半滑舌鳎的精巢中表达,而在雌、雄鱼的脑、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、皮肤、心肌、肠、头肾、鳃、皮肤、小肠、眼以及雌鱼的卵巢中都不表达。与对照组雄鱼和经过甲基睾酮（Methyltestosterone,MT）浸浴处理和高温处理的雄鱼一样,Dmrt1α也在甲基睾酮（MT）处理和高温诱导的由雌性性反转为雄性的精巢中表达,而未经诱导或诱导不成功的雌鱼中仍没有Dmrt1α表达,这些结果表明Dmrt1α可能参与了半滑舌鳎的雄性性别决定过程。

奥利亚罗非鱼DMRT1基因推导蛋白的结构和功能预测

利用生物信息学的方法对DMRT1基因推导的氨基酸序列进行结构特征和功能域预测分析,探讨了DMRT1的信号肽、亲/疏水性、跨膜拓扑结构、卷曲螺旋结构、基序、功能域及高级结构。结果表明:DMRT1基因推导蛋白不含螺旋卷曲区域,没有信号肽,是一个非跨膜的亲水性稳定蛋白,该蛋白以游离形式存在于细胞质内,不会发生跨膜运动。DMRT1基因推导蛋白包含两个相同的保守的功能结构域,分别行使性别调控,使DNA形成二聚体和结合回纹结构的功能。DMRT1基因推导蛋白含有多个磷酸化位点,推测它可能在细胞信号传导中发挥作用,且其生物活性可能接受信号途径中多种信号的调控。DMRT1的高级结构中含有两个α-螺旋区域。以上结论为实验室研究奥利亚罗非鱼DMRT1基因编码蛋白的功能,为明确DMRT1基因与性别调控的关系奠定了基础。

半滑舌鳎Dmrt1蛋白表达、纯化及功能

通过分析半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）Dmrtl重组蛋白注射卵巢后基因表达调控，探讨Dmrtl在半滑舌鳎性别决定与分化中的功能。实验利用原核表达系统（Pet-32a）对半滑舌鳎Dmrtl基因进行重组表达，并通过亲和层析纯化获得了重组目的蛋白（Pet-32-dmrtl）。重组蛋白注射卵巢后实时定量PCR分析结果显示，Cypl9a和Foxl2在6～24h内两基因表达量均显著下调，Sox9a基因表达量在6～24h内有显著上调，但48h后3个基因的表达量逐渐恢复正常表达水平。研究结果证实，Dmrtl重组蛋白具有生物活性，且对性别相关基因表达调控具有一定的影响，在性别决定中发挥一定作用。

尼罗罗非鱼性别相关基因Dmrt1的RACE扩增和序列分析

[目的]为研究Dmrt基因的进化、尼罗罗非鱼性别决定机制和功能提供资料。[方法]以尼罗罗非鱼精巢cDNA为模板,采用简并PCR扩增和克隆其Dmrt保守区域,并采用3′RACE反应获得Dmrt1基因全序列。[结果]尼罗罗非鱼中Dmrt保守区域长度为158 bp。尼罗罗非鱼Dmrt1基因的DM-domain与奥利亚罗非鱼、虹鳟、青鱼将、新月鱼、人、小鼠中Dmrt1基因的DM-domain和尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼中DMO基因的DM-domain的核苷酸同源性分别为98.6%、87.9%、81.4%、82.1%、77.9%、77.1%、72.1%、72.1%,氨基酸同源性为100.0%9、7.8%、87.0%、87.0%、89.1%、89.1%、84.8%和84.8%。通过3′RACE反应,获得1 108 bpDmrt1的3′端序列。尼罗罗非鱼Dmrt1与奥利亚罗非鱼、虹鳟、青鱼将、新月鱼的氨基酸序列同源性分别为99.0%、62.0%、41.0%和73.0%。[结论]Dmrt1基因具有高度保守性。

奥利亚罗非鱼DMRT1,DMO基因片段的克隆及序列分析

根据其他鱼类DMRT基因中的保守序列设计了一对简并引物,利用RT-PCR扩增了雌雄奥利亚罗非鱼的DMRT基因,并对其扩增产物进行了克隆与测序。结果在雌雄奥利亚罗非鱼个体中获得了两个不同的片段,分别命名为DMO,DMRT1基因。序列同源性分析表明,奥利亚罗非鱼DMRT1,DMO cNA系列的同源性为61.78%,氨基酸同源性为86%,说明了DMRT基因存在性别差异。与尼罗罗非鱼、红鳍东方豚、虹鳟、青鱼将等鱼类DM保守区相比,氨基酸序列同源性为86%-100%,这充分显示了DM-RT基因在进化上的高度保守性。

黑鲷DMRT1基因cDNA片段的克隆和序列分析

根据其他鱼类DMRT1基因中的保守序列设计了一对简并引物 ,利用反转录 多聚酶链式反应 (RT PCR)的方法克隆了黑鲷 (Acanthopagrusschlegeli)DMRT1基因cDNA的一个片段 .该片段长 13 8bp ,推导的氨基酸序列由 45个氨基酸残基组成 .同源性分析表明 。

尼罗罗非鱼Dmrt1基因克隆及在不同组织中的表达

Dmrt1基因是Dmrt基因家族的一个重要成员,在动物性别决定过程中发挥重要作用。参照小鼠Dmrt1基因DM保守区及有关文献,设计了1对简并引物,扩增了尼罗罗非鱼的Dmrt1基因,并对扩增产物进行了亚克隆与测序。结果在雌雄尼罗罗非鱼个体中各获得1个预期的基因片段,长度为140bp,序列无性别差异。序列同源性分析表明,尼罗罗非鱼Dmrtl基因DM盒区核苷酸序列与人和鼠相应基因的同源性为78%;编码的氨基酸序列与人和鼠相应基因编码序列的同源性为89%,充分显示了Dmrt1基因在进化上的高度保守性。进一步根据获得的Dmrt1序列,设计1对特异引物,采用RT-PCR技术对尼罗罗非鱼不同组织Dmrt1基因的表达进行了研究。结果发现,Dmrt1只在精巢中特异表达,在卵巢、眼、肠、鳃及心脏组织中无表达,提示该基因在性别分化和功能维持上可能具有重要作用。

DMRT1单倍体不足导致性发育异常

目的增加对DMRT1基因单倍体不足导致性发育异常的认识,提高性发育异常疾病的诊断水平。方法描述1例染色体为46XY性发育异常患者的临床特点;对患者及其父母的静脉血进行淋巴细胞培养和染色体核型分析;抽取患者外周血,提取基因组DNA,进行微阵列比较基因组杂交技术(a CGH)扫描。结果 1)患者表现为女性外阴,超声未见子宫和卵巢组织;伴随发育延迟和运动迟缓;临床表现符合"9p缺失综合征";2)染色体结果:患者母亲46XX,t(7;9)(q35,p24);父亲46XY;患儿46XY,der(9)t(7;9)(q35,p24);3)a CGH扫描结果:患儿第7号染色体长臂部分(144741153-159098761)重复,长约14.37 Mb;第9号染色体短臂部分(10001-9733061)缺失,长约9.72 Mb,缺失部分包含EZH2、MNX1、DMRT1、DMRT2、SHH、SMARCA2、GLDC、VLDLR、DOCK8和GLIS3基因。结论 DMRT1在性腺发育过程中发挥重要作用。母亲染色体发生平衡易位,因无遗传物质丢失,故不导致疾病发生。在产生配体过程中,因DMRT1单倍体剂量不足,导致子代睾丸发育障碍。

家兔Dmrt1全长cDNA的克隆和组织表达

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)和RACE的方法克隆了家兔Dmrt1全长cDNA基因。氨基酸序列分析表明,家兔Dmrt1与其他哺乳类Dmrt1基因的氨基酸序列同源性较高,而与鱼类、两栖类、鸟类等氨基酸序列的同源性较低。RT-PCR分析表明,Dmrt1基因只在家兔的精巢和卵巢中表达,而在脑、垂体、肺、心脏、肝脏、肠、脾脏、肾、肌肉等组织中均不表达,且精巢中的表达量高于卵巢。这一结果表明,Dmrt1可能参与了家兔的性别决定过程。

奥利亚罗非鱼性别相关基因DMRT1克隆及其分析

从奥利亚罗非鱼精巢提取总RNA,采用RT和3’RACE(rapid amplification of cDNA ends)法分离和测定了奥利亚罗非鱼DMRT1(DM-related transcription factor1)cDNA的3’序列,扩增得到1086bp的片段,阅读框共编码254个氨基酸,序列分析结果表明,奥利亚罗非鱼DMRT1基因的氨基酸序列与尼罗罗非鱼DMRT1基因的同源性为99%,与黑鲷、黄鳝、新月鱼、虹鳟、青鳉鱼等动物的DMRT1cDNA和尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼等动物的DMO(DM-domain gene in Ovary)cDNA的同源性分别为:80%、78%、73%、62%、41%、26%、26%。说明DM-RT1基因具有高度的保守性,在不同物种中差别较小,但是与DMO的同源性很低。