DcR3 mRNA在白血病细胞中的表达及意义

目的:探讨DcR3 mRNA在急性白血病(AL)细胞中的表达及其临床意义。方法:选择AL患者46例,其中急性髓系白血病(AML)28例,急性淋巴细胞白血病(ALL)18例,27例非恶性血液病患者作为对照组,采用RT-PCR方法检测骨髓单个核细胞(BMNC)中DcR3 mRNA的表达水平,并分析其与临床参数的关联性。结果:AL组DcR3 mRNA表达阳性率(67.4%)及表达水平(0.56±0.09)高于对照组(40.7%,0.39±0.19)(P<0.05);AML组DcR3 mRNA表达阳性率(71.4%)及表达水平(0.56±0.09)与ALL组(61.1%,0.53±0.08)比较差异无显著性(P>0.05);AL患者DcR3 mRNA的阳性表达率在白细胞计数≥30×109.L-1时升高。结论:DcR3基因可能通过抑制白血病细胞凋亡途径参与白血病发病过程。

胃癌组织中Survivin和DcR3基因的表达及临床意义

目的探讨胃癌组织中Survivin和DcR3基因的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测50例胃癌组织及其对应的50例正常胃黏膜中Survivin、DcR3 mRNA的表达情况。结果胃癌中Survivin、DcR3 mRNA的阳性表达率均明显高于正常胃黏膜组织(均P<0.01),二者的表达水平在胃癌中呈正相关(P<0.01);Survivin、DcR3 mRNA的表达水平均与胃癌的组织分化程度、淋巴转移、TNM分期有关(均P<0.05)。结论联合检测Survivin和DcR3有助于判断胃癌预后,可能是临床评价胃癌恶性程度的重要指标。

DcR3反义RNA表达载体的构建及表达

目的构建DcR3反义RNA表达载体PVAXⅠasDcR3,并研究其对肝癌细胞中DcR3蛋白表达的影响。方法从肝癌组织中提取总RNA,RTPCR法克隆出DcR3基因片段,将其与PMD18T载体连接,经BamHⅠ、XholⅠ双酶切TADcR3及PVAXⅠ()真核表达载体后,使用T4DNA连接酶连接,构建反义DcR3表达载体。转染肝癌细胞株SMMC7721。Westernblot法检测DcR3蛋白表达。结果用RTPCR方法从肝癌组织中扩增出DcR3片段,并经测序证实。重组质粒经酶切鉴定正确,转染肝癌细胞株SMMC7721后,经Westernblot证实DcR3蛋白表达较对照组下降。结论成功构建反义RNA表达载体PVAXⅠasDcR3,构建的反义表达载体PVAXⅠasDcR3具有阻断DcR3基因表达的效应。

DcR3在消化系统肿瘤细胞中的表达

目的:研究诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)在消化系统肿瘤细胞中的表达差异,阐明其与消化系统肿瘤的相关性。方法:体外培养结肠癌细胞(SW480)、胃癌细胞(SGC7901)、肝癌细胞(HepG2)和人成纤维细胞(3T3),采用RT-PCR法检测DcR3 mRNA的表达水平;应用Western印迹法检测DcR3蛋白的表达水平。结果:SW480细胞的DcR3 mRNA和蛋白表达水平均高于SGC7901、HepG2和3T3细胞的表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:DcR3在结肠癌细胞中的高表达可能与结肠癌的发生、发展有关。

人结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤DcR3基因的RNA干扰及其作用

目的:观察DcR3基因小干扰RNA(siRNA)对人结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤DcR3基因表达的影响。方法:建立结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤模型,瘤体注射脂质体与DcR3siRNA混合物,转染DcR3siRNA,免疫组织化学及RT-PCR检测观察DcR3基因的表达。结果:建立了结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤模型;治疗后,治疗组移植瘤明显减小,空白对照组、阴性对照组肿瘤体积显著大于治疗组(P<0.01);各组肿瘤组织中DcR3基因均有不同程度的表达,治疗组表达程度明显低于阴性对照组及空白对照组(RT-PCRP<0.05,免疫组化P<0.01)。结论:人结肠癌SW480细胞在裸鼠皮下有良好的成瘤性;脂质体与DcR3siRNA混合物可特异性抑制结肠癌裸鼠皮下移植瘤内DcR3基因的表达。

人DcR3cDNA克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆人DcR3分子的cDNA,将其重组入真核表达载体,并表达于COS-7细胞。方法以PCR方法克隆编码人DcR3分子的cDNA,对其序列进行测定。将测序正确的DcR3cDNA克隆入真核表达载体pAAV-IRES-hrGFP,构建重组表达载体。采用脂质体法转染COS-7细胞,用Western blot检测和激光共聚焦检测重组DcR3分子在COS-7细胞中的表达。结果PCR方法扩增出一1000bp左右的基因片段,插入pAAV-IRES-hrGFP构建重组表达载体后,经序列测定证实扩增的片段为人DcR3分子cDNA。将重组子转染COS-7细胞,Western blotting和激光共聚焦检测到DcR3分子的表达。结论成功地克隆并在COS-7细胞中表达了DcR3分子。

靶向DcR3的siRNA抑制人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的实验研究

目的以脂质体为载体,探讨靶向诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)的siRNA对人结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用。方法裸鼠背部皮下种植结肠癌SW480细胞,建立结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤模型。针对靶标DcR3基因,利用Dharmacon公司软件设计并合成siRNA序列,通过瘤体局部多点注射脂质体与DcR3 siRNA混合物,将DcR3 siRNA转染到裸鼠背部皮下移植瘤内。同时设立阴性对照组和空白对照组。观察肿瘤治疗前后体积变化,评价DcR3 siRNA对肿瘤的抑制作用;比较肿瘤治疗前后的细胞形态学改变;免疫组织化学及RT-PCR检测DcR3基因表达;原位细胞凋亡检测肿瘤的凋亡情况。结果治疗组肿瘤体积明显小于对照组,肿瘤组织内坏死面积增大,细胞凋亡率显著增高,DcR3蛋白表达水平降低。治疗过程中裸鼠生长良好,无明显毒性反应。结论脂质体介导的DcR3 siRNA对裸鼠皮下结肠癌SW480细胞移植瘤有明显抑制、杀伤作用,细胞凋亡是DcR3 siRNA所致肿瘤细胞死亡的重要形式。

重组人DcR3腺相关病毒的构建和表达

目的克隆人DcR3基因于腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体pAAV-IRES-hrGFP中,以获得高感染滴度及纯度的重组人DcR3腺相关病毒,为将其用于感染移植肝,研究其对大鼠移植肝的保护作用打下基础。方法用基因重组的方法构建含全长人DcR3基因的重组腺相关病毒骨架质粒,利用脂质体法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞AAV-293细胞中,合成重组DcR3腺相关病毒,经PEG/氯仿纯化,用SDS-PAGE鉴定其纯度,扫描电镜观察病毒颗粒形态,倍比稀释法测定重组病毒的感染滴度。并用重组病毒感染COS-7细胞鉴定DcR3的表达。结果正确构建组装重组人DcR3腺相关病毒,纯化后病毒感染滴度为1.1×1010U/mL。在重组DcR3腺相关病毒感染的COS-7细胞上清液中检测到了DcR3的表达。结论成功构建了重组人DcR3腺相关病毒,为下一步研究DcR3对大鼠移植肝的保护作用打下基础。

ERK干扰质粒的构建及对胃癌细胞株BGC823 DcR3表达的影响

目的探讨胃癌发展的分子机制,通过构建ERK1/2shRNA真核表达载体,体外研究其对人胃癌细胞株BGC823ERK1/2蛋白及DcR3表达水平的影响。方法应用PRNAT-U6.1/Neo载体构建ERK1/2基因shRNA重组质粒,经脂质体法导入BGC823细胞中,分别设置对照组、干扰组和U0126抑制剂组。Westernblot法检测转染后BGC823细胞及抑制剂使用后ERK1/2蛋白的表达变化,荧光显微镜检测质粒自带GFP基因的表达情况确认转染效率,ELISA法检测各组细胞上清中DcR3分泌蛋白的表达特点。结果成功构建ERK1/2基因shRNA重组质粒。证明了ERK1/2蛋白的表达与DcR3的分泌水平在BGC823细胞株中呈正相关。结论 ERK1/2干扰质粒明显降低BGC823细胞的ERK1/2蛋白表达水平,ERK信号通路对DcR3的分泌具有重要调控作用,为其下游调控机制的研究奠定了基础。

DcR3基因检测在恶性肿瘤研究中的地位

目的 :检测 Dc R3在肺癌细胞株的表达 ,为肿瘤的发病机制研究开辟一条新途径。方法 :用半定量 RT- PCR方法 ,初步检测正常人 P外周血单核细胞 (BMC)及 NCH4 4 6肺癌细胞株中 Dc R3m RNA的相对表达水平。结果 :健康人 PBMC中 Dc R3基因的相对表达水平较低 (0 .2 5 9± 0 .0 84 ,n =5 ) ,在 NCH 4 4 6肺癌细胞株中有高水平的表达 (0 .6 5 2 )。结论 :Dc

RNA干扰靶向沉默诱骗受体3基因增加人胰腺癌细胞的放射敏感性

目的:探讨RNA干扰沉默诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)基因对胰腺癌细胞放射敏感性的影响及其相关机制。方法:构建带有DcR3 siRNA序列的稳定表达质粒,通过脂质体转染至胰腺癌AsPC-1细胞株,设对照组、siRNA(-)阴性对照组和DcR3 siRNA组,应用Western blotting检测AsPC-1细胞中DcR3表达的变化,平板克隆形成实验检测转染DcR3 siRNA后AsPC-1细胞放射敏感性的变化,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blotting检测Caspase-8、Caspase-3和PARP-1表达的变化。结果:DcR3 siRNA组细胞中DcR3蛋白表达水平较对照或siRNA(-)组明显降低(均P<0.01);DcR3 siRNA组的克隆形成率明显低于对照或siRNA(-)组,其存活分数(survival fraction,SF)降低、α/β比值升高(均P<0.01);放射后DcR3 siRNA组肿瘤细胞凋亡率明显高于对照或siRNA(-)组(均P<0.01);转染DcR3 siRNA后可以明显上调Caspase-8、Caspase-3的表达和下调PARP-1的表达。结论:RNA干扰沉默DcR3基因通过激活凋亡因子Caspase-8和Caspase-3促进细胞凋亡,从而增加胰腺癌细胞对放射的敏感性。

siRNA介导人结肠癌细胞诱骗受体3基因表达抑制的研究

目的:研究siRNA对结肠癌细胞株SW480 DcR3基因表达的影响。方法:化学合成靶向DcR3基因的4组siRNA,用脂质体转染试剂转染结肠癌细胞株SW480,应用噻唑兰(MTT)法检测siRNA对细胞生长的作用,RT-PCR和Western blot方法检测DcR3基因mRNA水平和蛋白表达量的变化。结果:与对照组相比,MTT试验结果显示各组siRNA对细胞增殖均有明显的抑制效应,但此抑制效应随时间延长而减弱。Western blot结果显示DcR3蛋白表达量明显降低。RT-PCR显示,转染后细胞内DcR3 mRNA的表达量与空白对照组相比降低至24%。结论:DcR3 siRNA通过特异、高效地沉默结肠癌细胞DcR3 mRNA的表达,发挥抑制结肠癌细胞生长的作用。

HTLV-1病毒Tax蛋白对T淋巴细胞DcR3基因表达的影响

目的探讨H1]LV-1病毒Tax蛋白对T淋巴细胞DeR3基因表达的影响。方法构建pGL3-DeR3-luc（-1010bp-＋114bp）荧光素酶报告基因；利用脂质体介导的方法将pGL3-DcR3-luc转染到MT-2、TaxP、Jurkat细胞中，48h后检测DcR3荧光素酶报告基因的活性；利用脂质体介导的方法将梯度剂量的pCMV-Tax转染入Jurkat细胞，48h后提RNA逆转录，real-timePCR检测DeR3mRNA的表达的变化；选用流式细胞技术检测MT-2、TaxP、Jurkat细胞表面DeR3蛋白的表达。结果成功构建DcR3基因调控序列荧光素酶报告基因pGL3-DeR3．1ue；荧光素酶活性的检测显示，与对照组相比，MT2细胞荧光素酶活性升高了32．07±12．43倍，TaxP细胞荧光素酶活性升高了13．27＋4．04倍，Jurkat细胞荧光素酶活性升高了1．26_＋0．49倍。与Jurkat细胞相比，MT2细胞和TaxP细胞的相对荧光素酶活性明显升高（P〈0．01）；Real-timePCR结果显示，4组Ct内参／Ct目的基因的值依次是0．40±0．02、0．44±0．01、0．47±O．02、0．53±0．02；DeR3mRNA的表达与转染pCMV-Tax存在着剂量依赖性（P〈0．05）。流式细胞技术检测，MT2和TaxP细胞实验组DcR3蛋白的表达较对照组Jurkat细胞表达的高（P〈0．05）。MT2细胞的结果是33．1±9．9，Ta）‘P细胞的结果是35．1±4．8，Jurkat细胞的结果是16．9±2．3。结论Tax蛋白能够促进DeR3基因在T细胞中的表达。

原发性肝癌组织中陷井受体3基因表达与扩增的临床意义

目的 观察原发性肝癌组织中陷井受体 3(DcR3)基因的表达和扩增 ,探讨该基因在肝癌组织中过度表达的原因 ,分析临床病理学因素在肝癌DcR3基因表达和扩增中的作用。方法 对4 8例病理学证实的原发性肝癌患者的组织 ,利用RT -PCR检测癌组织及癌旁组织DcR3基因mRNA表达 ,荧光定量PCR检测该基因的扩增倍数 ,统计分析肝癌组织中DcR3基因表达与扩增的相关性 ,比较不同临床病理学类型肝癌中该基因表达及扩增的差异。结果 4 8例肝癌组织中DcR3基因mRNA阳性表达 2 9例 ,阳性率为 6 0 4 % ;癌旁组织无阳性表达。mRNA表达与肿瘤大小、临床分期及肿瘤的浸润和转移有关 (P <0 0 5 )。mRNA阳性表达组的基因扩增倍数为 1 5 3± 0 82 ,阴性组为 0 75± 0 33,其差异有显著意义 (P <0 0 1)。 4 8例患者的DcR3基因扩增倍数为 0 18～ 3 86 ,平均值为 1 2 2± 0 77,扩增倍数超过 2的患者共 7例 ,占 14 6 %。不同扩增倍数肝癌患者该基因mRNA的表达差异有显著意义 (P <0 0 1) ;不同临床病理学特征肝癌间DcR3基因的扩增倍数差异无显著意义 (P >0 0 5 )。序列分析发现其mRNA序列与源序列有 3个碱基改变。结论 (1)原发性肝癌组织中存在DcR3基因的高表达 ,对应的癌旁组织中未见表达 ;(2 )