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Gene cloning and sequence analysis of the cold-adapted chaperones DnaK and DnaJ from deep-sea psychrotrophic bacterium Pseudoalteromonas sp. SM9913 被引量:1
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作者 ZHAO Dianli CHEN Xiulan HE Hailun SHI Mei ZHANG Yuzhong 《Acta Oceanologica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2007年第6期91-100,共10页
Pseudoalteromonas sp. SM9913 is a phychrotmphic bacterium isolated from the deep-sea sediment. The genes encoding chaperones DnaJ and DnaK of P. sp. SM9913 were cloned by normal PCR and TAIL - PCR (GenBank accession ... Pseudoalteromonas sp. SM9913 is a phychrotmphic bacterium isolated from the deep-sea sediment. The genes encoding chaperones DnaJ and DnaK of P. sp. SM9913 were cloned by normal PCR and TAIL - PCR (GenBank accession Nos DQ640312, DQ504163 ). The chaperones DnaJ and DnaK from the strain SM9913 contain such conserved domains as those of many other bacteria, and show some cold-adapted characteristics in their structures when compared with those from psychro-, meso-and themophilic bacteria. It is indicated that chaperones DnaJ and DnaK of P. sp. SM9913 may be adapted to low temperature in deep-sea and function well in assisting folding, assembling and translocation of proteins at low temperature. This research lays a foundation for the further study on the cold-adapted mechanism of chaperones DnaJ and DnaK of cold-adapted microorganisms. 展开更多
关键词 COLD-ADAPTED chaperone DNAJ dnak DEEP-SEA Pseudoalteromonas sp. SM9913 gene cloning sequence analysis
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猪肺炎霉形体Dnak-P97融合基因的表达及其产物的生物学活性 被引量:7
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作者 王亮 乔祖健 +3 位作者 李媛 张建华 梁立 辛九庆 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期123-127,共5页
应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白DnakC末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6h。用BugBusterT... 应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白DnakC末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6h。用BugBusterTMNi-NTA His.Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性。 展开更多
关键词 猪肺炎霉形体 猪霉形体肺炎 P97基因 伴侣蛋白dnak 热休克蛋白70
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猪肺炎支原体DnaK基因的表达及ELISA方法建立 被引量:8
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作者 刘茂军 丁志勇 +9 位作者 刘冬霞 杜海霞 缪芬芳 甘源 孔猛 冯志新 熊祺琰 白方方 杜改梅 邵国青 《金陵科技学院学报》 2011年第4期79-84,共6页
猪肺炎支原体(Mhp)是猪气喘病的主要病原体。利用Mhp NJ株的DnaK基因通过SOE-PC(splicing withoverlap extension PCR)R扩增和突变,获得了目的片段并插入表达载体pET-28a(+)中,然后转入宿主菌BL21(DE3)。重组质粒经1 mmol/L IPTG在37... 猪肺炎支原体(Mhp)是猪气喘病的主要病原体。利用Mhp NJ株的DnaK基因通过SOE-PC(splicing withoverlap extension PCR)R扩增和突变,获得了目的片段并插入表达载体pET-28a(+)中,然后转入宿主菌BL21(DE3)。重组质粒经1 mmol/L IPTG在37°C温度下诱导5 h,目的蛋白可达到总蛋白的14.1%。Western Blotting证明表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体反应原性,用该重组蛋白建立的ELISA方法可检测到猪肺炎支原体抗体。此为该病基因工程疫苗抗原的筛选和ELISA诊断试剂盒的研制奠定基础。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 dnak 重组蛋白 活性鉴定
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布鲁氏菌DnaK基因缺失株的构建及其功能初步评价 被引量:2
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作者 张俊波 印双红 +6 位作者 易继海 张红 方维焕 王嘉福 郭飞 李志强 陈创夫 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第11期992-997,共6页
为获得毒力较弱并能够区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究采用PCR方法扩增布鲁氏菌疫苗株DnaK基因上下游同源臂序列及卡那基因序列,并利用融合PCR将以上基因序列融合,构建p DM18-T-ΔDnaK-Kana打靶载体。电转化至布鲁氏... 为获得毒力较弱并能够区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究采用PCR方法扩增布鲁氏菌疫苗株DnaK基因上下游同源臂序列及卡那基因序列,并利用融合PCR将以上基因序列融合,构建p DM18-T-ΔDnaK-Kana打靶载体。电转化至布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选该菌疫苗株M5-90的DnaK基因缺失株,并对获得的M5-90ΔDnaK遗传稳定性、生长曲线、毒力和细胞免疫指标进行检测。结果表明,M5-90ΔDnaK与M5-90体外生长曲线相似, M5-90ΔDnaK在胞内的存活能力显著低于M5-90 (p<0.05), M5-90和M5-90ΔDnaK诱导小鼠血清IFN-γ水平相似(p>0.05),并且均显著高于PBS组(p<0.01)。结果表明,M5-90ΔDnaK有望成为毒力低且可诱导机体细胞免疫的疫苗候选株。本研究为布鲁氏菌致病机制的研究和疫苗的研发提供科学依据。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 dnak基因 同源重组 存活能力
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dnaK操纵子研究进展 被引量:1
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作者 戴莹 刘金凤 +1 位作者 牛雪薇 张志民 《牙体牙髓牙周病学杂志》 CAS 2015年第7期446-449,共4页
dna K操纵子在G+菌中包含grp E、dna J、hrc A等基因成员。基于16S r DNA序列的研究发现,链球菌、乳球菌、清酒乳杆菌、分支杆菌具有密切亲缘关系。本文就己发现的dan K操纵子的基因及其结构、功能和可能的作用机制作一综述。
关键词 dnak操纵子 基因 分子机制
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可承载CETP多肽表位的颗粒样蛋白表达载体的克隆、表达与分离纯化 被引量:1
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作者 龙军 吴洁 +1 位作者 曹荣月 刘景晶 《药物生物技术》 CAS CSCD 2006年第4期237-243,共7页
为了提高多肽表位的免疫原性,利用乙肝病毒核心抗原能够在体外自行组装成病毒样颗粒的特性,将人源胆固醇酯转运蛋白羧基端26个氨基酸连同大肠杆菌DnaK基因C端结构域克隆入乙肝病毒核心抗原的免疫优势决定区,并在大肠杆菌BL-21(DE3)表达... 为了提高多肽表位的免疫原性,利用乙肝病毒核心抗原能够在体外自行组装成病毒样颗粒的特性,将人源胆固醇酯转运蛋白羧基端26个氨基酸连同大肠杆菌DnaK基因C端结构域克隆入乙肝病毒核心抗原的免疫优势决定区,并在大肠杆菌BL-21(DE3)表达,以包含体形式存在,经过洗涤、复性和分子筛纯化,获得纯度达90%以上的目的蛋白。纯化的蛋白免疫新西兰大白兔后能够诱导产生高水平的抗胆固醇酯转运蛋白的抗体,表明乙肝病毒核心抗原能够在体外自发装配成多聚体颗粒,并能够将插入其免疫优势决定区的胆固醇酯转运蛋白(CETP)多肽表位展示于颗粒表面以提高免疫原性,显示出其作为疫苗免疫载体的良好前景。 展开更多
关键词 乙肝病毒核心抗原 病毒样颗粒 dnak基因 胆固醇酯转运蛋白 包含体 纯化
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慢生根瘤菌属结瘤基因的进化及遗传分析 被引量:4
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作者 侯卫国 连宾 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期118-126,共9页
根瘤菌中存在一系列控制固氮结瘤因子(lipo-chito-oligosaccharides)合成的结瘤基因(nodulationgenes)。其中,nodA基因是合成结瘤因子所必需的,该基因负责酰基转移酶的合成,能将不饱和脂肪酸转移到结瘤因子寡聚糖骨架上;基因nodZ,nolL和... 根瘤菌中存在一系列控制固氮结瘤因子(lipo-chito-oligosaccharides)合成的结瘤基因(nodulationgenes)。其中,nodA基因是合成结瘤因子所必需的,该基因负责酰基转移酶的合成,能将不饱和脂肪酸转移到结瘤因子寡聚糖骨架上;基因nodZ,nolL和noeI为宿主专一性结瘤基因,分别转录合成岩藻糖基转移酶,岩藻糖乙酰化酶和岩藻糖甲基化酶。通过GenBank调取慢生根瘤菌属及其他根瘤菌属的结瘤基因nodA,nodZ,nolL和noeI,构建系统发育树,进行进化和遗传分析。结果表明,慢生根瘤菌属各个菌株的nodA,nodZ,nolL和noeI具有很高的相关性,但是与根据保守基因16SrDNA和dnaK分类情况不完全相符。这表明慢生根瘤菌属的结瘤基因主要是通过直系遗传的,同时可能为适应宿主及环境条件,结瘤基因有少量的平行转移。结果表明,慢生根瘤菌属各个菌株的nodA,nodZ,nolL和noeI具有很高的同源性,同时发现基于保守基因16SrDNA和dnaK对慢生根瘤菌的分类情况与慢生根瘤菌属各菌株在nodA,nodZ,nolL和noeI具有较高同源性的事实不完全相符。这表明慢生根瘤菌属的结瘤基因主要是通过直系遗传的,同时可能为适应宿主及环境条件,结瘤基因有少量的平行转移。 展开更多
关键词 慢生根瘤菌属 进化 遗传分析 结瘤基因 16S RDNA dnak
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滑液支原体DnaK的原核表达及免疫原性分析和亚细胞定位 被引量:8
8
作者 刘佳 张生英 +3 位作者 邢小勇 武小椿 温峰琴 包世俊 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期1029-1036,共8页
参照GenBank中滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)WVU1853株dnaK基因序列(CP011096.1)设计并合成特异性引物,利用overlap PCR技术扩增获得MS dnaK基因,并将其克隆至pMD19-T载体,在序列分析的基础上将该基因克隆至pET-28a(+)质粒,构建... 参照GenBank中滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)WVU1853株dnaK基因序列(CP011096.1)设计并合成特异性引物,利用overlap PCR技术扩增获得MS dnaK基因,并将其克隆至pMD19-T载体,在序列分析的基础上将该基因克隆至pET-28a(+)质粒,构建原核表达载体pET-dnaK并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,进行SDS-PAGE分析。继而将纯化表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA、Western-blot和免疫荧光试验对MS DnaK的免疫原性及其在细胞内的分布进行分析。结果显示,MS dna K基因全长1 791 bp,编码596个氨基酸,重组蛋白rMSDnaK在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,且其相对分子质量约为67 ku。间接ELISA和Western-blot结果表明,rMSDnaK具有良好的免疫原性,且MS DnaK在其胞浆和胞膜中均有分布,但在胞膜中含量较多,免疫荧光试验进一步证实DnaK在MS膜表面的分布。本研究结果为进一步研究MS DnaK的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 滑液支原体 dnak基因 免疫原性 亚细胞定位
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酸土脂环酸芽孢杆菌DnaK基因克隆及生物信息学分析 被引量:1
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作者 刘明鹏 焦凌霞 +2 位作者 李刚 梁新红 孙俊良 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第7期199-206,共8页
利用同源克隆和基因组步移技术克隆得到酸土脂环酸芽孢杆菌(DSM 3922T)DnaK基因全序列,其ORF全长1 854 bp,编码617个氨基酸,推测其氨基酸序列与来源于A.acidocaldarius LAA1的分子伴侣蛋白DnaK同源性最高,相似性达86%。利用同源建模对D... 利用同源克隆和基因组步移技术克隆得到酸土脂环酸芽孢杆菌(DSM 3922T)DnaK基因全序列,其ORF全长1 854 bp,编码617个氨基酸,推测其氨基酸序列与来源于A.acidocaldarius LAA1的分子伴侣蛋白DnaK同源性最高,相似性达86%。利用同源建模对DnaK的二级结构和超二级结构的预测结果显示,该伴侣蛋白主要由α-螺旋和β-折叠组成,基本不含无规则卷曲,具有耐热蛋白质的特征。 展开更多
关键词 酸土脂环酸芽孢杆菌 dnak基因 克隆 生物信息学分析
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赤红球菌SD3全基因组测序及其热休克蛋白DnaK的表达分析 被引量:1
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作者 樊欣 彭仁 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期1613-1620,共8页
红球菌属微生物因其自身较强的有机物耐受性和较宽的降解谱,能够适应多种生境而被广泛应用于生物脱硫、石油污染修复、有毒有机化合物降解、污水处理等领域。本研究利用单分子PacBio测序技术,对一株耐有机溶剂的赤红球菌SD3(Rhodococcus... 红球菌属微生物因其自身较强的有机物耐受性和较宽的降解谱,能够适应多种生境而被广泛应用于生物脱硫、石油污染修复、有毒有机化合物降解、污水处理等领域。本研究利用单分子PacBio测序技术,对一株耐有机溶剂的赤红球菌SD3(Rhodococcus ruber SD3)全基因组进行测序并进行生物信息学分析。该菌株的全基因组长度大约为5.37 Mb,GC含量为70.63%,GenBank序列登录号为CP029146。使用Barrnap0.4.2和tRNAscan-SEv1.3.1软件对基因组中包含的rRNA基因和tRNA基因进行预测,发现有12个rRNA基因和53个tRNA基因。利用Glimmer3.02软件对该基因组进行基因预测,共得到5120个编码蛋白的基因。将预测的蛋白序列同时与KEGG、STRING和GO三类数据库进行Blastp比对,共计2836个蛋白基因获得COG功能注释,并且注释得到3130条GO功能条目和2190条KEGG通路条目。此外,基于荧光定量PCR的分析表明在甲苯和苯酚胁迫下,赤红球菌SD3中热休克蛋白DnaK的表达分别上调了29.87倍和3.93倍。这些研究结果为赤红球菌的遗传改造和揭示赤红球菌的有机溶剂耐受性机制提供了理论依据。 展开更多
关键词 赤红球菌 全基因组测序 功能注释 dnak基因 荧光定量PCR
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结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究 被引量:18
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作者 程继忠 郑波 +2 位作者 肖红梁 驹卿 皇甫永穆 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1998年第5期337-341,共5页
目的在重组分枝杆菌中表达编码人结核杆菌(TB)热休克蛋白70(HSP70)的DnaK基因,并观察其对小鼠的免疫效应。方法采用基因工程和免疫学技术将DnaK基因及其两侧的表达调控区一起从质粒pMT-70中切出,经末端修... 目的在重组分枝杆菌中表达编码人结核杆菌(TB)热休克蛋白70(HSP70)的DnaK基因,并观察其对小鼠的免疫效应。方法采用基因工程和免疫学技术将DnaK基因及其两侧的表达调控区一起从质粒pMT-70中切出,经末端修饰后装入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pBCG-2000中,构建成新的重组质粒pBCG-TB70,并用以转化耻垢分枝杆菌及大肠杆菌,用Westernblot检测表达的HSP70;以重组耻垢分枝杆菌分别经皮下及腹腔免疫小鼠,用淋巴细胞刺激指数(SI)反映细胞增殖能力,以NO法检测巨噬细胞吞噬活性,并检测血清中特异性抗TBHSP70的抗体。结果TBHSP70能在分枝杆菌中表达,表达量占菌体总蛋白量的10%,不能在大肠杆菌中表达;重组耻垢分枝杆菌以106CFU的剂量经皮下免疫小鼠后,可使小鼠脾淋巴细胞刺激指数(SI)和腹腔巨噬细胞吞噬活性增高(P<0.05),并能刺激机体产生特异性抗TBHSP70的抗体,腹腔免疫激发的抗体滴度较皮下免疫为低,而SI无明显改变。结论构建的表达质粒pBCG-TB70能在耻垢分枝杆菌中表达HSP70,该重组菌具有较强的免疫原性。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 基因转移 免疫原性 表达
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沙门菌NASBA快速检测试剂的研制 被引量:2
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作者 陈守义 宋榴艳 +2 位作者 张颖 庞杏林 巩向丽 《中国卫生检验杂志》 CAS 2010年第12期3297-3298,共2页
目的:建立一种快速、简便的恒温核酸扩增(NASBA)方法。方法:用AMV RTase、RNase H、,T7 RNA聚合酶以及相应的缓冲成分组成的恒温扩增系统,对dnak基因RNA序列进行扩增。结果:经50 min反应后均可扩增出预期120pb大小的产物,第1次PCR产物... 目的:建立一种快速、简便的恒温核酸扩增(NASBA)方法。方法:用AMV RTase、RNase H、,T7 RNA聚合酶以及相应的缓冲成分组成的恒温扩增系统,对dnak基因RNA序列进行扩增。结果:经50 min反应后均可扩增出预期120pb大小的产物,第1次PCR产物经转录实验后与NASBA直接扩增的产物具有较好的同源性,其灵敏度达到103CFU。结论:NASBA法对沙门菌检测具有良好的特异性和灵敏度。 展开更多
关键词 恒温核酸扩增 沙门菌 dnak基因
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