激活α7nAchR促进肥胖小鼠的脂肪稳态和米色脂肪生成及产热作用

目的观察肥胖小鼠脂肪组织形态学改变以及脂代谢、炎症等相关指标的异常表现,探索激活α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nAchR)促进肥胖机体白色脂肪米色化产热的作用机制。方法取诱导成肥胖小鼠40只和10只低脂进食小鼠,分为空白组、高脂组、模型组、激动剂组、抑制剂组(10只/组)。苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠附睾白色脂肪组织,评估细胞数量、大小及形态。ELISA检测白色脂肪组织肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1(IL1β)、白细胞介素10(IL10)、转化生长因子-β(TGF-β)表达水平。qRT-PCR检测白色脂肪一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg1)mRNA。PCR检测解偶联蛋白(UCP-1)、PR结构域蛋白16(PRDM-16)、线粒体生成的关键调节因子(PGC-1α)mRNA水平。Western blot检测白色脂肪核转录因子P65(NF-κB P65)、磷酸化蛋白酪氨基酸激酶2(p-JAK2)、磷酸化传导及转录激活因子3(p-STAT3)表达水平。结果与空白组比较,高脂组体质量明显增加(P<0.01),白色脂肪组织中出现较多脂肪空泡,脂滴明显增大,iNOS mRNA及TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.01),而Arg-1 mRNA及IL-10、TGF-β水平降低(P<0.01);而与模型组相比,药物干预的3组体质量均有所减轻(P<0.05),白色脂肪中脂滴缩小。激动剂组白色脂肪中PRDM-16、PGC-1α、UCP-1 mRNA下降最为明显。而激动剂组TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05,P<0.01),IL-10、TGF-β水平升高(P<0.01),M1/M2巨噬细胞比值降低。结论激活α7 nAchR后可以改善应用β3受体激动剂产生的白色脂肪组织稳态受损,促进白色脂肪中M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化减轻白色脂肪炎症反应,促进白色脂肪组织米色化,提高米色化产热效能。

α7nAChR激动剂经内质网应激调控NLRP3炎症小体改善缺氧缺血性脑损伤的分子机制研究

目的探究α7nAChR激动剂通过介导内质网应激(ERS)调控NLRP3炎症小体表达对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的影响及可能机制。方法选择出生7 d左右的SPF级SD雄性大鼠48只,随机分为假手术组(S组)、模型组(HIBD组)、HIBD+α7nAChR激动剂PNU282987组(HP组),每组16只。HIBD组和HP组大鼠均进行HIBD模型复制;S组进行假手术,不做结扎和缺氧处理。HP组模型复制成功后1 h腹腔注射0.8 mg/kg PNU282987,HIBD组和S组同时间腹腔注射等量生理盐水。模型复制48 h后采用水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;HE染色观察脑组织病理变化;TTC染色法检测脑梗死面积;TUNEL法检测大脑皮质、海马CA1区神经细胞凋亡;Western blotting检测脑组织中NLRP3蛋白及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)的相对表达量。结果水迷宫实验结果显示,3组大鼠逃避潜伏期、穿越圆台次数比较,差异有统计学意义(P<0.05);ELISA检测结果显示,HIBD组和HP组大鼠血清IL-18、IL-1β水平较S组升高(P<0.05),HP组大鼠血清IL-18、IL-1β水平较HIBD组降低(P<0.05);HE染色结果显示,S组脑皮层完整,细胞排列正常,无明显神经元损伤,HIBD组可见脑皮层神经元排列较为紊乱,细胞间隙变宽,细胞膜破裂,HP组神经元排列紊乱,水肿程度、坏死程度较HIBD组轻;TTC染色结果显示,S组无明显梗死灶,HIBD组和HP组均可见白色梗死灶,其中HP组梗死面积占比明显低于HIBD组(P<0.05);TUNEL法结果显示,HIBD组和HP组大鼠脑皮层和海马CA1区神经细胞凋亡率较S组升高(P<0.05),HP组大鼠脑皮层和海马CA1区神经细胞凋亡率较HIBD组降低(P<0.05);Western blotting检测结果显示,HIBD组和HP组大鼠NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相对表达量较S组升高(P<0.05),HP组NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相对表达量较HIBD组降低(P<0.05)。结论α7nAChR激动剂可改善大鼠HIBD,其机制可能与其能抑制ESR途径、降低NLRP3炎症小体表达有关。

ChAT/α7nAChR/核因子κB信号途径在类风湿关节炎发病中的免疫调控

背景:胆碱能抗炎通路广泛参与类风湿关节炎发生发展,然而胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)/烟碱型乙酰胆碱7受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)/核因子κB信号途径在类风湿关节炎发病中的免疫调控机制研究未见报道。目的:探究类风湿关节炎发病中ChAT/α7nAChR/核因子κB信号途径的免疫调控机制。方法:取32只雌性Wistar大鼠,采用随机数字表法分为4组,每组8只:除健康对照组外,关节炎模型组、迷走神经切断组和假手术组均采用牛Ⅱ型胶原和弗氏完全/不完全佐剂构建关节炎大鼠模型,造模成功后,迷走神经切断组切断颈部左侧迷走神经,假手术组仅分离迷走神经。术后5周,检测各组大鼠体质量、关节炎评分和关节肿胀度、脾脏及关节病理变化,ELISA检测血清白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平,qRT-PCR及Western blot、免疫组化检测ChAT/α7nAChR/核因子κB通路核心基因mRNA及蛋白表达。结果与结论:①与健康对照组相比,关节炎模型组大鼠体质量下降(P<0.05),关节炎评分升高(P<0.01),踝关节肿胀度加重,关节间隙减小伴炎细胞浸润,脾脏白髓及生发中心增大增多,血清白细胞介素、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平升高(P<0.05,P<0.01),关节中α7nAChR、ChAT、IκBα、核因子κB p50/p65的mRNA及蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),在关节面中显著表达;②与关节炎模型组和假手术组相比,迷走神经切断组大鼠体质量下降(P<0.05),关节炎评分升高(P<0.05,P<0.01),踝关节肿胀度加重伴畸形,关节间隙消失伴炎细胞浸润,脾脏白髓及生发中心增大融合,血清白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平升高(P<0.05,P<0.01),关节中α7nAChR、ChAT、IκBα、核因子κB p50/p65 mRNA及蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),在关节面中显著表达;③结果提示,迷走神经通过调控胆碱能抗炎通路刺激ChAT/α7nAChR/核因子κB信号途径,进而参与类风湿关节炎的疾病进程,提示胆碱能抗炎通路可能是治疗类风湿关节炎的潜在靶标。

大鼠靶向α7nAchR基因shRNA真核表达载体及重组腺病毒构建

目的构建大鼠烟碱样乙酰胆碱受体α7亚型(α7nAchR)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体。方法设计并合成编码α7nAchR基因shRNA的DNA模板引物AY318、AY857、AY444+559、AY318+857,并分别与线性化的质粒载体pGenesil-1.1、pGenesil-1.4、pGenesil-1.2,pGenesil-1.3连接,以构建可以编码1条α7nAchR基因shRNA和编码2条α7nAchR基因shRNA的重组质粒载体;重组质粒载体感染感受态的DH5a细胞,提取细菌质粒进行特定酶切,并用1%的琼脂糖凝胶电泳以鉴定重组质粒是否构建成功;用LR体外同源重组法将AY318、AY444+559、AY857shRNA表达框分别从重组质粒pGenesil转移至腺病毒pGSadeno质粒表达载体上,构建重组腺病毒质粒;用相同的方法感染DH5a细胞,并鉴定重组腺病毒pGSadeno质粒是否构建成功;提取线性化的重组腺病毒DNA并转染包装细胞HEK293,经放大培养获得滴度为1.0×1010pfu/mL的重组腺病毒上清;将重组腺病毒感染大鼠GH3垂体瘤细胞,以PCR反应鉴定重组腺病毒载体的α7nAchR基因干扰效果。结果通过酶切片段及其大小,初步判断AY318、AY857、AY444+559、AY318+857shRNA成功重组入质粒载体,重组腺病毒pGSadeno-shRNA包装成功;重组腺病毒感染HEK293细胞,在荧光显微镜下有绿色荧光蛋白表达;重组腺病毒感染GH3细胞后α7nAchR mRNA表达显著减少,且pGSadeno-AY857shRNA干扰效果最明显(85%)。结论具有感染力和干扰大鼠α7nAchR基因表达的shRNA真核表达载体构建成功,且pGSadeno-AY857shRNA具有最强的基因干扰效果。

α7nAchR 713T>C突变对阿尔茨海默病小鼠认知功能和tau蛋白磷酸化的影响

目的研究α7n AchR 713T>C突变对阿尔茨海默病(AD)小鼠认知功能和tau蛋白磷酸化的影响。方法 3月龄敲除α7n AchR基因的APPSwe小鼠(APPa7KO小鼠)20只,随机分为2组,每组10只,分别在AD小鼠海马注射突变型和野生型7nAchR cDNA,注射后采用Morris水迷宫检测APPa7KO小鼠认知功能的变化,免疫组化方法检测AD小鼠tau(Thr231)表达。结果与注射野生型7nAchR cDNA小鼠相比,注射突变型7nAchR cDNA小鼠的逃避潜伏期和游泳距离延长,小鼠海马tau(Thr231)阳性细胞数显著增多(P<0.01)。结论α7n AchR 713T>C突变加重了AD小鼠的认知功能损害和tau蛋白磷酸化。

迷走神经刺激对难治性癫痫大鼠海马神经炎性反应及α7nAChR表达的影响

目的:探讨迷走神经刺激(VNS)对难治性癫痫(IE)模型大鼠海马神经炎性反应及α7nAChR表达的影响。方法:80只成年雄性SD大鼠,SPF级,随机分为对照组、模型组、VNS组、甲基牛扁亭(MLA)+VNS组,其中对照组与MLA+VNS组分别20只,模型组与VNS组因模型制作失败与动物死亡,分别剩下15只和14只。除对照组之外,其余各组皆通过腹腔注射皮罗卡品建立氯化锂-皮罗卡品IE大鼠模型。对照组仅分离迷走神经,不采取电刺激;模型组不采取任何干预措施;VNS组在模型制作成功后7 d采取VNS,连续4周;MLA+VNS组先侧脑室给药MLA(3.4μg/μl,5μl),然后给予VNS,连续4周。观察并记录各组大鼠癫痫发作的次数与持续时间的变化;然后断头处死大鼠,快速分离海马并制备10%组织匀浆,离心并提取上清液,通过分光光度法测定上清液中AChE、ChAT活性;ELISA法检测TNF-ɑ、IL-6和IL-1β表达;Western blot检测海马组织α7nAChR蛋白表达;免疫荧光染色法检测海马组织α7nAChR与小胶质细胞共表达。结果:(1)通过VNS治疗4周后,大鼠癫痫发作的频率以及持续的时间都明显低于模型组(P<0.01);MLA阻断后在给予VNS,大鼠癫痫发作的频率以及持续的时间也明显低于模型组,但高于VNS组(P<0.01)。(2)与对照组比较,模型组大鼠海马组织ChAT表达明显下降,AChE表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,VNS组与MLA+VNS组大鼠海马组织ChAT表达明显升高,AChE表达明显降低(P<0.01);与VNS组比较,MLA+VNS组大鼠海马组织ChAT、AChE表达无明显变化(P>0.05)。(3)与对照组比较,模型组大鼠海马组织TNF-ɑ、IL-6和IL-1β表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,VNS组大鼠海马组织TNF-ɑ、IL-6和IL-1β表达明显降低(P<0.01);与VNS组比较,MLA+VNS组大鼠海马组织TNF-ɑ、IL-6和IL-1β表达明显升高(P<0.01)。(4)与对照组比较,模型组大鼠海马组织以及小胶质细胞上α7nAChR表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,VNS组大鼠海马组织以及小胶质细胞上α7nAChR表达明显上调(P<0.01);与VNS组比较,MLA+VNS组海马小胶质细胞上共表达α7nAChR数量明显减少(P<0.01)。结论:VNS对IE大鼠有明显的治疗作用,其机制可能是通过直接激活海马小胶质细胞CAP,抑制海马神经炎性反应来实现的。

六味地黄汤含药脑脊液对α7nAChR保护作用的实验研究

目的探讨六味地黄汤含药脑脊液对Aβ1-40诱导的α7nAChR缺失的保护作用,为六味地黄汤防治AD提供实验依据。方法观察细胞形态,以MTT法测定细胞活性、免疫细胞化学法测定α7nAChR的表达量。结果六味地黄汤含药脑脊液1天20%+1μMAβ1-40组和10天20%+1μMAβ1-40组能改善细胞生长状况,明显上调PC12细胞活性(P<0.05,P<0.01),增加α7nAChR的表达(P<0.05,P<0.01),但给药1天和10天其结果无显著性差异(P>0.05)。结论六味地黄汤含药脑脊液能抑制Aβ1-40的神经毒性作用,保护α7nAChR。

α7nAChR在氯化甲基汞神经毒性中的作用

为探讨环境染污染物氯化甲基汞(methylmercury chloride,Me Hg Cl)的神经毒性作用机制,采用MTT、免疫细胞荧光、dot Blot、qRT-PCR等实验技术检测Me Hg Cl对PC12细胞活性及其α7亚型烟碱型胆碱能受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7n AChR)蛋白和mRNA表达水平的影响。结果显示Me Hg Cl抑制PC12细胞活性,显著降低α7n AChR的蛋白和mRNA的表达水平,呈浓度依赖性。上述结果表明,Me Hg Cl对神经细胞毒性作用可能与抑制α7n AChR表达有关。

枸杞多糖含药血清对Aβ激活星形胶质细胞分泌炎症因子和α7nAChR表达的影响

目的研究枸杞多糖(LBP)含药血清对Aβ1-40激活的海马星形胶质细胞(astrocyte,AC)分泌炎性因子TNF-α、IL-6和α7nAChR表达的影响。方法 4月龄SD大鼠分别灌胃给予LBP和等量蒸馏水,常规制备含药血清;原代培养SD大鼠海马AC,经纯化鉴定后随机分为对照组、Aβ1-40组、药物组。各药物组为在加入Aβ1-40前12h预先分别加入:尼古丁、甲基牛扁亭(MLA)、LBP血清和空白血清,各组加Aβ1-40后继续培养24、48和72h。MTS法检测细胞的增殖活性;ELISA检测TNF-α和IL-6的浓度;免疫荧光染色和Western Blot检测α7nAChR的表达。结果 1原代培养的AC纯度达到95%以上,达到实验要求;2与对照组相比,Aβ1-40激活后的AC增殖活性和TNF-α、IL-6的浓度均升高(P均<0.05),α7nAChR的表达明显增多(P<0.05);3与Aβ1-40组比较:给予尼古丁和MLA后,AC增殖活性和TNF-α、IL-6的浓度以及α7nAChR的表达均降低(P均<0.05),给予LBP血清后,TNF-α、IL-6的浓度和α7nAChR的表达明显减少(P均<0.05),但AC增殖活性仍显著升高(P<0.05);LBP血清组与尼古丁组在Aβ1-40激活24和72h时α7nAChR的表达接近,与MLA组在Aβ1-40激活24h时接近。结论 LBP含药血清能降低Aβ1-40诱导的海马AC升高的TNF-α、IL-6水平和α7nAChR的高表达。

PNU-282987对颞叶癫痫模型大鼠认知功能的影响及机制

目的研究特异性α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)激动剂PNU-282987对颞叶癫痫(TLE)模型大鼠认知功能的影响及机制。方法将60只大鼠随机分为对照组、模型组、PNU-282987组(3 mg/kg)和甲基牛扁亭(MLA)+PNU-282987组(6 mg/kg MLA+3mg/kgPNU-282987),每组15只。除对照组之外,其余各组大鼠均制备TLE模型。造模成功后,各组大鼠腹腔注射相应药物或生理盐水,每天1次,连续2周。观察大鼠癫痫发作行为并进行评分,记录发作持续时间;检测大鼠认知功能;观察海马组织CA1区神经元病理学形态;检测海马组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和IL-1β水平;检测海马组织中离子钙接头蛋白1(IBA-1)阳性表达和α7nAChR、核因子κB(NF-κB)p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白表达水平。结果与模型组比较,PNU-282987组大鼠癫痫评分和发作持续时间,海马组织中IBA-1阳性细胞数量和TNF-α、IL-6、IL-1β水平以及NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平均显著减少/降低(P<0.05);逃避潜伏期时间显著缩短(P<0.05),原平台象限停留时间及穿越平台次数均显著增加(P<0.05);海马组织CA1区神经元损伤明显减轻;海马组织中α7nAChR蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与PNU-282987组比较,MLA+PNU-282987组大鼠上述指标均显著逆转(P<0.05)。结论PNU-282987可改善TLE模型大鼠的认知功能障碍,其机制可能是通过激活α7nAChR/NF-κB信号通路,抑制小胶质细胞介导的炎症反应,进而减轻海马神经元损伤。

慢性睡眠剥夺对小鼠海马胶质细胞α7-nAChR影响的研究

目的探讨慢性睡眠剥夺对小鼠海马组织α7-nAChR表达及星形胶质细胞和小胶质细胞表面α7-nAChR的表达的影响。方法成年C57BL/6J小鼠随机分为3组:正常对照(control,CC)组、慢性睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)组、慢性睡眠剥夺后腹腔注射α7-nAChR激动剂PHA-543613(SD+PHA-543613)组。采用Western印迹、实时荧光定量PCR分别检测各组小鼠海马组织α7-nAChR蛋白及基因的表达;使用免疫荧光染色法观察各组小鼠海马组织星形胶质细胞、小胶质细胞表面α7-nAChR的表达变化。结果 SD组与CC组比较,SD组海马组织的α7-nAChR蛋白表达、mRNA表达和星形胶质细胞表面α7-nAChR的表达均明显低于CC组(P=0.001,P=0.038,P=0.003);SD组与SD+PHA-543613组比较,SD+PHA-543613组海马组织的α7-nAChR蛋白表达、mRNA表达和星形胶质细胞表面α7-nAChR的表达较SD组升高(P=0.037,P=0.002,P=0.027)。结论慢性睡眠剥夺不仅抑制海马组织α7-nAChR基因及蛋白的表达,同时降低α7-nAChR在星形胶质细胞表面的表达,海马组织胶质细胞α7-nAChR的减少可能是慢性睡眠剥夺后认知功能下降的危险因素。

青藤碱对肺癌细胞A549中COX2、α7nAChR和A2A表达的影响

【目的】观察青藤碱(sinomenine,SIN)对环氧化酶2(COX2)、α7烟碱型乙酰胆能受体(α7nAChR)和腺苷受体(A2A)表达变化的影响,探讨青藤碱对A549细胞增殖的抑制作用及机制。【方法】采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测青藤碱和4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)对A549细胞增殖的影响;细胞划痕实验观察青藤碱和NNK对A549细胞迁移的影响;Western blot法观察青藤碱和NNK对A549细胞COX2蛋白表达的影响;RT-PCR和Western blot法观察青藤碱和NNK对A549细胞α7n ACh R、A2A表达的影响。【结果】NNK能促进增殖和迁移,青藤碱能抑制A549细胞增殖和迁移;NNK组COX2蛋白质水平增加,青藤碱组COX2蛋白质水平下降;NNK组α7n ACh R、A2A的表达增加,青藤碱组α7n ACh R、A2A表达下降。【结论】青藤碱能通过抑制COX2蛋白表达发挥抗A549细胞增殖和迁移作用;青藤碱对α7n ACh R和A2A受体的表达均有抑制作用。

电针内关穴对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中M2AChR、α7nAChR的影响

目的:观察不同频率电针内关穴对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护效应及对心肌组织中M2AChR、α7nAChR的影响。方法:将32只大鼠随机分为假手术组、模型组、低频电针组和高频电针组,采用结扎冠状动脉前降支(LAD)的方法制备模型,电针刺激于术前7 d进行。观察心电图(ECG) ST段幅值的变化,并检测大鼠血清中CK-MB、LDH的水平,检测大鼠左室心肌组织中M2毒蕈碱M2受体(M2AChR)、α7烟碱受体(α7nAChR)的表达。结果:低频电针组结扎后30 min的心电图ST段、血清CK-MB和LDH的水平均较模型组显著降低(P <0.01或P <0.05),左室心肌组织中M2AChR、α7nAChR的表达显著增加(P <0.01或P <0.05)。高频电针组未观察到上述效应。结论:低频电针预处理能够减轻心肌缺血再灌注损伤,并可上调心肌组织中M2AChR、α7nAChR的表达。

α7-nAChR/PI3K/AKT/GSK-3β通路在慢性睡眠剥夺后的保护作用及其机制研究

目的观察α7-nAChR/PI3K/AKT/GSK-3β通路在慢性睡眠剥夺后的保护作用,并探讨其作用机制。方法成年C57BL/6J小鼠随机分为3组:对照(CC)组、慢性睡眠剥夺(SD)组、慢性睡眠剥夺后腹腔注射α7-nAChR激动剂-PHA-543613(SD+PHA-543613)组。采用Western-blot印迹检测各组小鼠海马组织α7-nAChR及p-AKT、p-GSK-3β、Nrf-2、HO-1蛋白表达变化;使用实时荧光定量PCR检测各组小鼠海马组织α7-nAChR mRNA水平及炎性因子与抑炎因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、MCP-1、Arg-1、CD206、TGF-β、YM-1mRNA表达水平;采用免疫荧光染色法观察各组小鼠海马组织星形胶质细胞、小胶质细胞表面α7-nAChR的表达变化;通过水迷宫评估小鼠的行为学。结果慢性睡眠剥夺7 d后,SD组海马组织的α7-nAChR蛋白、mRNA的表达明显低于CC组(P=0.001,P=0.038),SD组海马组织p-AKT蛋白表达显著低于CC组(P=0.019),p-GSK-3β蛋白表达量高于CC组(P=0.011);慢性睡眠剥夺后腹腔注射α7-nAChR激动剂-PHA-543613后海马组织星形胶质细胞表面α7-nAChR的表达高于SD组(P=0.027),p-AKT、p-GSK-3β的蛋白表达也明显高于SD组(P=0.047,P=0.017);腹腔注射α7-nAChR激动剂-PHA-543613后,SD+PHA-543613组海马组织Nrf-2、HO-1蛋白表达量和抑炎因子CD206、TGF-β的mRNA表达量与SD组相比明显增多(P=0.020,P=0.016,P<0.01,P<0.01),而促炎因子TNF-α、MCP-1的mRNA表达量与SD组相比显著下降(均P<0.01)。腹腔注射α7-nAChR激动剂-PHA-543613后小鼠的逃避潜伏期与SD组相比缩短,处于目标象限时间延长、穿越平台次数增多(P=0.000,P=0.000,P=0.001)。结论慢性睡眠剥夺后刺激α7-nAChR通过激活PI3K/AKT/GSK-3β减轻神经炎症和氧化应激。

电针足三里对紫杉醇诱导神经性疼痛小鼠脾脏及脊髓背角α7nAChR调控炎症的机制研究

目的:探讨电针足三里对化疗药物紫杉醇诱导神经性疼痛(PINP)小鼠脾脏及脊髓背角α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)影响炎症变化的作用机制。方法:选择雄性成年C57BL/6小鼠60只,体质量18~22 g,按照随机数字表法分为对照组、模型组、电针组、腹腔拮抗剂组、鞘内拮抗剂组,每组12只。模型组、电针组、腹腔拮抗剂组和鞘内拮抗剂组腹腔隔日注射紫杉醇(2 mg/kg),总计4次,建立PINP模型,对照组给予同等容量的生理盐水。电针组、腹腔拮抗剂组、鞘内拮抗剂组从造模第1天开始进行电针干预,隔日1次,共干预7次。腹腔拮抗剂组、鞘内拮抗剂组分别于造模第1、7、13天分别在腹腔、鞘内注射α7nAChR拮抗剂α-银环蛇毒素(α-BGT)。采用Von Frey测痛仪及热刺痛仪检测造模第0、7、14天小鼠机械痛阈值(PWT)及热痛阈值(PWL)的变化;采用Western blot检测造模第14天小鼠脾脏、脊髓背角α7nAChR蛋白表达;采用RT-qPCR及ELISA法检测造模第14天小鼠脾脏、脊髓背角TNF-αmRNA水平及蛋白表达的变化。结果:(1)行为学测试:5组小鼠造模前PWT和PWL比较,差异无统计学意义(P>0.05);模型组造模第7、14天PWT和PWL较同时段对照组小鼠显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);电针组造模第7、14天PWT和PWL较同时段模型组小鼠明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);腹腔拮抗剂组、鞘内拮抗剂组小鼠造模第7、14天PWT和PWL较同时段电针组小鼠显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。(2) α7nAChR蛋白表达测试:与对照组比较,模型组小鼠脾脏及脊髓背角α7nAChR蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,电针组小鼠脾脏及脊髓背角α7nAChR蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)TNF-αmRNA水平及蛋白表达测试:与对照组比较,模型组小鼠脾脏、脊髓背角TNF-αmRNA水平及蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,电针组小鼠脾脏、脊髓背角TNF-αmRNA水平及蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与电针组比较,腹腔拮抗剂组、鞘内拮抗剂组小鼠脾脏、脊髓背角TNF-αmRNA水平及蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:电针足三里可能通过上调脾脏、脊髓背角α7nAChR表达,降低脾脏、脊髓背角炎症因子TNF-α释放,从而减轻PINP小鼠机械痛和热痛觉过敏。

青藤碱对α7nAChR参与的巨噬细胞M2极化和小鼠肝癌TAM极化的干预作用

目的 观察青藤碱对巨噬细胞M2极化及小鼠肝癌腹水瘤模型腹腔肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)的影响。方法 细胞实验以白细胞介素(IL)-4(10 ng·mL^(-1))单独或与IL-6联合(即IL-4+IL-6,浓度均为10 ng·mL^(-1))刺激小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7诱导M2极化,青藤碱(400μmol·L^(-1))干预后,ELISA法检测IL-10分泌量;荧光定量PCR法检测精氨酸酶1(Arg-1)、Fizz1和Ym1的mRNA表达水平;免疫印迹法检测α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)表达。动物实验分为正常组、模型组、青藤碱(40 mg·kg^(-1))组,采用小鼠肝癌细胞H22腹腔注射诱导小鼠腹水瘤模型,灌胃给药4 d,分离各组小鼠腹腔巨噬细胞,流式检测CD86、CD206和α7nAChR表达。结果 IL-4或IL-4+IL-6联合诱导后,M2极化指标Arg-1、Fizz1和Ym1的mRNA相对表达量及IL-10分泌量升高(P<0.05);IL-4+IL-6组明显高于IL-4单独组(P<0.05),且α7nAChR表达升高(P<0.05);青藤碱可下调M2表型,也可下调α7nAChR表达(均P<0.05)。肝癌腹水瘤小鼠腹腔肿瘤相关巨噬细胞与正常小鼠腹腔巨噬细胞比较,其CD86表达下降(P<0.05),CD206、α7nAChR表达上调(P<0.05);青藤碱干预后,CD86表达上调(P<0.05),CD206、α7nAChR表达下降(P<0.05)。结论 α7nAChR表达与M2极化和肿瘤相关巨噬细胞极化正相关,青藤碱能下调α7nAChR表达,抑制M2极化、促进肝癌腹水瘤中肿瘤相关巨噬细胞向M1极化。

α7nAChR的抗炎及神经保护作用研究进展

烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors,n ACh Rs)是配体门控离子通道蛋白,广泛分布于中枢和外周神经系统,在神经元和非神经元细胞中表达,参与各种生理反应。其亚型α7nAChR的抗炎及神经保护作用日益受到关注,被认为是一个潜在的治疗神经系统疾病和炎症的作用靶点。本文总结了α7nAChR在神经系统及非神经系统的分布和表达,在免疫反应中的作用(胆碱能抗炎通路),以及神经保护作用,并指出小胶质细胞α7nAChR可作为抗炎通路治疗靶点。

Elabela通过α7nAChR/JAK2/STAT3信号通路改善心肌缺血/再灌注损伤的机制研究

目的探讨Elabela在心肌缺血/再灌注损伤中的作用机制。方法检测急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者体内Elabela的浓度,通过获取临床血样和体外建立氧化应激模型来模拟缺血再灌注损伤,评估Elabela在大鼠心肌细胞(H9C2)中的表达和作用。结果STEMI患者血浆中Elabela的浓度和经过氧化氢(H_(2)O_(2))处理的H9C2细胞中Elabela表达均升高(P均<0.001)。Elabela可降低H9C2细胞凋亡相关蛋白Bax水平、心肌细胞凋亡率、活性氧阳性细胞数、乳酸脱氢酶水平和丙二醛水平;增加经H_(2)O_(2)处理的H9C2细胞的超氧化物歧化酶活性和Bcl-2表达(P均<0.05)。特异性抑制剂α-银环蛇毒素对α7nAChR/JAK2/STAT3信号通路的抑制抵消了部分Elablela的保护作用。结论Elabela通过激活α7nAChR/JAK2/STAT3信号通路改善H_(2)O_(2)诱导的H9C2细胞损伤。

七氟烷对衰老模型大鼠认知功能及海马α7nAChR的影响

目的研究发现α7nAChR与认知功能的改变有密切的关系,而老年患者由于其年龄特殊性成为了术后认知功能障碍发生的高危群体,文章探讨了七氟烷对衰老模型大鼠认知功能及海马内α7nAChR的影响。方法成年健康雄性SD大鼠共72只,连续6周头颈部皮下注射D-半乳糖,复制衰老模型大鼠。模型大鼠随机分为:对照组(n=18)予以运载气体(2 L/min Air+2 L/min O2)6 h;七氟烷组(Sev组,n=18)予以体积分数为3.2%七氟烷+运载气体6 h;七氟烷+α7nAChR拮抗剂组(Sev+M组,n=18):注射拮抗剂24 h后,处理同Sev组;七氟烷+α7nAChR激动剂组(Sev+P组,n=18):注射激动剂24 h后,处理同Sev组。各组大鼠分别于麻醉苏醒后2 h、1周、4周后,以水迷宫法做行为学检测;每周期行为学检测结束后,腹腔注射麻醉取大鼠海马组织,RT-qPCR法测定海马内α7nAChR mRNA表达;Western blot法测定海马α7nAChR蛋白表达。结果苏醒后2 h,Sev组、Sev+M组、Sev+P组大鼠工作记忆逃避潜伏期[(17.1±1.5、18.2±1.6、8.0±1.3)s]均较对照组[(4.2±1.3)s]对应时间延长(P<0.05),Sev+P组较Sev组及Sev+M组明显缩短(P<0.05);苏醒后1周Sev组及Sev+M组[(15.3±2.5、23.3±1.8)s]较对照组[(10.9±1.3)s]明显延长(P<0.05)。各组大鼠麻醉苏醒后2 h,Sev组大鼠平台穿越次数、有效区域穿越次数及平台象限穿越次数与Con比较均明显下降(P<0.05);Sev+M组平台象限穿越次数,有效区域穿越次数及平台象限穿越次数百分比较对照组明显下降(P<0.05);麻醉苏醒后1周,Sev组大鼠平台象限穿越次数与对照组比较明显下降(P<0.05);Sev+P组大鼠有效区域穿越次数及平台象限穿越次数较Sev+M组明显升高(P<0.05)。与对照组比较,其余各组苏醒后2 h及1周α7nAChR mRNA和蛋白表达均下调(P<0.05);4周α7nAChR mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05)。结论吸入3.2%七氟烷6 h可引起衰老模型大鼠海马内α7nAChR代谢紊乱并导致大鼠短期内(1周)学习记忆能力下降,但这种影响具有可逆性。而α7nAChR激动剂PNU-282987能够缓解七氟烷引起的短暂性的学习记忆能力下降。

激活α7烟碱型乙酰胆碱能受体(α7nAchR)增加小鼠海马组织M2型小胶质细胞数量并减轻脓毒症脑病

目的检测α7烟碱型乙酰胆碱能受体(α7nAchR)对M2型小胶质细胞的影响,探索其减轻脓毒症脑病(SAE)的机制。方法采用盲肠结扎穿刺术(CLP)于2月龄雄性C57BL/6小鼠构建SAE模型,比较两组小鼠学习记忆能力的改变。采用Western blot法检测海马组织中α7nAchR的表达变化。给予腹腔注射α7nAchR的激动剂二甲氧基苯亚胺基假木贼碱(GTS-21),观察给予激动剂后海马组织中α7nAchR的表达变化,同时探索GTS-21是否能减轻SAE小鼠的学习记忆障碍。通过免疫荧光细胞化学染色法检测精氨酸酶1(ARG1)、离子钙结合接头蛋白1(Iba-1)的表达确定SAE小鼠M2型小胶质细胞数量的变化,以及GTS-21对M2型小胶质细胞数量的影响。结果SAE小鼠的新物体识别及恐惧记忆能力显著下降,小鼠海马组织中α7nAchR表达显著降低。GTS-21可改善SAE小鼠的学习记忆障碍,增加脑组织中α7nAchR的表达。同时,脓毒症小鼠海马组织中M2型小胶质细胞显著减少,而GTS-21可显著增加M2型小胶质细胞的数量。结论SAE小鼠海马组织中α7nAchR表达降低,使抑制炎症反应的M2型小胶质细胞减少,GTS-21可显著增加M2型小胶质细胞数量,减轻SAE小鼠的学习记忆障碍。