三氧化二砷诱导人食管癌Ec109细胞凋亡伴随c-myc基因的降调节

目的 探讨三氧化二砷 (As2 O3)对食管癌 Ec10 9细胞系的生物学效应及细胞和分子机制。方法 通过四氮唑 (MTT)还原法检测三氧化二砷 (As2 O3)对食管癌 Ec10 9细胞系存活率的影响 ,从形态观察、流式细胞仪分析、DNA凝胶电泳、细胞凋亡原位检测 (TU NEL)研究三氧化二砷诱导食管癌 Ec10 9细胞凋亡的情况 ,并以 Western blot检测基因表达。结果 Ec10 9细胞经 As2 O3处理后 ,存活率明显降低。光学显微镜下可见到明显的凋亡细胞 ,在细胞周期 G1期前有低于 2倍体的凋亡峰 ;DNA凝胶电泳显示出典型的凋亡特征 :DNA有规律断裂形成的梯状图谱 ,细胞凋亡原位检测发现 DNA断裂 ,Western blot检测表明 c- myc基因的表达下降。结论 As2 O3能诱导人食管癌Ec10 9细胞凋亡 ,并伴随 c- m yc基因的降调节。

肿瘤转移抑制基因-1在食管鳞癌组织及食管癌EC109细胞中的表达及意义

目的探讨肿瘤转移抑制基因-1(TMSG-1)在食管鳞癌(ESCC)组织及食管癌EC109细胞中的表达及意义。方法采用SP免疫组织化学染色法检测136例ESCC及37例正常食管黏膜组织中TMSG-1蛋白的表达情况,分析TMSG-1与ESCC患者临床病理指标的关系;培养人食管癌EC109细胞并用常用化疗药物顺铂(CDDP)干预,同时设对照组,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,半定量RT-PCR法检测细胞TMSG-1的表达情况。结果 TMSG-1在ESCC和正常食管黏膜的阳性率分别为52.2%(71/136)、94.6%(35/37),差异具有统计学意义(P<0.05)。TMSG-1的异常表达与ESCC组织学分级、患者的TNM分期、淋巴结转移情况相关。顺铂干预组EC109细胞的增殖抑制率较对照组显著增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR结果显示,干预组EC109细胞TMSG-1的mRNA表达明显高于对照组(P<0.01)。结论 TMSG-1的异常表达与ESCC的发展及转移相关,可作为较为理想的肿瘤标志物辅助诊断并指导临床治疗。

苦参碱通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导食管癌Ec109细胞自噬

目的探究苦参碱对食管癌Ec109细胞的自噬作用及其机制。方法体外培养食管癌Ec109细胞,分别经不同浓度苦参碱处理后,倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化;四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖抑制率;Western blotting检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白p-mTOR、p-Akt和p-p70S6K的表达;实时荧光定量PCR检测自噬相关基因Beclin1 mRNA的表达。结果倒置显微镜下可见,食管癌Ec109细胞经苦参碱处理后胞体缩小,胞内可发现不均一的细颗粒状物质。不同浓度的苦参碱处理48 h,细胞增殖抑制率随着苦参碱浓度的增加逐渐升高(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,LC3-Ⅱ的表达随苦参碱浓度的升高而增高,但p-mTOR、p-Akt和p-p70S6K的表达均随苦参碱浓度的增高而降低;实时荧光定量PCR结果显示,苦参碱处理使自噬基因Beclin1 mRNA的表达上调。结论苦参碱诱导食管癌细胞自噬可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路介导的。

沉默ABCE1基因对人食管癌EC109细胞凋亡、增殖、侵袭及迁移的影响

目的:探讨电转法沉默ATP结合盒转运子E1(ATP-binding cassette protein E1,ABCE1)基因的表达对人食管癌EC109细胞凋亡、增殖、侵袭及迁移的影响。方法:合成靶向ABCE1的siRNA序列(ABCE1-siRNA)以及阴性对照序列(NCsiRNA),电转法转染至EC109细胞,分别形成ABCE1-EC109、NC-siRNA-EC109细胞。RT-PCR、Western blotting检测转染后EC109细胞中ABCE1 mRNA与蛋白的表达情况,流式细胞术检测EC109细胞周期及凋亡,CCK-8法、划痕愈合实验、Transwell法分别检测EC109细胞的增殖、迁移以及侵袭的能力。结果:ABCE1-EC109细胞中ABCE1 mRNA和蛋白表达较NC-siRNAEC109细胞明显降低[(0.47±0.04)vs(0.67±0.05),(0.63±0.09)vs(0.86±0.11);均P<0.05]。与NC-siRNA-EC109细胞相比,ABCE1-EC109细胞的增殖速度明显减慢[(2.20±0.10)vs(2.91±0.13),P<0.05],细胞周期阻滞在G0/G1期细胞数目明显增多[(76.5±3.1)%vs(56.1±2.7)%,P<0.05)];细胞的凋亡率明显升高[(15.46±3.12)%vs(0.54±0.24)%,P<0.01],迁移、侵袭能力均显著下降[迁移:(8.12±0.23)vs(1.91±0.11)μm,P<0.05;侵袭:(42.56±4.68)vs(68.78±6.98)个,P<0.01]。结论:电转法沉默ABCE1基因的表达可促进食管癌EC109细胞的凋亡,抑制其体外增殖、侵袭及迁移。

杨梅素通过抑制能量代谢促进5-氟尿嘧啶对人食管癌细胞EC109的抗肿瘤作用

目的研究杨梅素(MYR)对5-氟尿嘧啶(5-FU)抗肿瘤作用的促进效应,并探讨其潜在机制。方法①人食管癌细胞EC109分别设立细胞对照组、MYR 4.68~300.00μmol·L^(-1)组、5-FU 0.8~48.0μmol·L^(-1)组和5-FU 0.8~48.0μmol·L^(-1)+MYR 75μmol·L^(-1)组,分别孵育24,48和72 h,采用MTT法检测细胞存活抑制率。②EC109细胞分为细胞对照、MYR 75μmol·L^(-1)、5-FU 12μmol·L^(-1)和MYR+5-FU组,孵育48 h,荧光显微镜观察线粒体膜电位(MMP);流式细胞术检测细胞凋亡率、MMP和葡萄糖摄取。③细胞分组为细胞对照组、MYR 75,100和200μmol·L^(-1)组、5-FU 12μmol·L^(-1)组及MYR 75μmol·L^(-1)+5-FU 12μmol·L^(-1)组。细胞能量代谢分析仪每隔5 min实时检测细胞氧消耗速率(OCR)和胞外酸化率(ECAR),检测150 min。结果①MYR 75~300μmol·L^(-1)浓度范围内作用48和72 h,均可显著抑制EC109细胞存活(P<0.01);5-FU 3~48μmol·L^(-1)浓度范围内作用48和72 h,均能抑制食管癌细胞EC109存活(P<0.01);5-FU 0.8~48.0μmol·L^(-1)+MYR 75μmol·L^(-1)组作用48和72 h时,MYR 75μmol·L^(-1)表现出对5-FU的增敏作用,当作用24 h时,MYR则对5-FU表现出拮抗作用。②与细胞对照组相比,MYR 75μmol·L^(-1),5-FU 12μmol·L^(-1)和MYR+5-FU作用EC109细胞48 h,细胞凋亡率均显著升高(P<0.01);与单用组相比,联用组细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。MYR 75μmol·L^(-1)组和5-FU 12μmol·L^(-1)组MMP显著下降(P<0.05);与单用药组相比,联用组MMP显著下降(P<0.01);葡萄糖摄取结果显示,与细胞对照组相比,MYR 75μmol·L^(-1)组细胞葡萄糖摄取显著下降(P<0.01),而5-FU 12μmol·L^(-1)组无明显变化;与单用药组相比,联用组可显著抑制葡萄糖摄取(P<0.01)。③能量分析结果显示,MYR 75,100和200μmol·L^(-1)组OCR和ECAR显著降低(P<0.05);5-FU 12μmol·L^(-1)组细胞OCR显著降低(P<0.05),而ECAR有所升高(P<0.05);与单用药组相比,联用组OCR进一步下降(P<0.05),ECAR无明显变化。结论MYR可促进5-FU对EC109的杀伤作用,其机制可能与MYR抑制细胞酵解和线粒体呼吸水平、抑制肿瘤细胞能量代谢有关。

环巴胺对人食管癌EC109细胞转移的影响及作用机制

目的探讨环巴胺特异性阻断人食管癌EC109细胞Hedgehog(Hh)信号通路后对其转移能力的影响及其可能的机制。方法环巴胺处理EC109细胞48 h后,采用Transwell小室、血管生成实验观察细胞的迁移、侵袭及血管形成等转移能力,RT-PCR检测Gli-1mRNA的表达,Western blot检测Gli-1、MMP-9、VEGF蛋白的表达。结果环巴胺阻断Hh信号通路能显著减弱EC109细胞迁移、侵袭及血管形成能力(P<0.05);Gli-1mRNA表达量降低,Gli-1、MMP-9、VEGF蛋白的表达量均降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论环巴胺能显著抑制EC109细胞的转移能力,其可能机制与抑制Gli-1进而使下游MMP-9、VEGF表达下调有关。

腺苷诱导人食管癌EC109细胞凋亡及其内质网分子机制

目的探讨内质网应激途径在腺苷诱导食管癌EC109细胞凋亡中的作用。方法腺苷2 mmol.L-1作用于EC109细胞24～72 h或腺苷0.5～4 mmol.L-1作用于EC109细胞36 h,MTT法观察腺苷对EC109细胞存活率的时效和量效关系;免疫荧光法检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78),胱天蛋白酶4,胱天蛋白酶3,转录因子CHOP和核因子κB(NF-κB)的表达及亚细胞定位;原位末端转移酶标记技术检测细胞凋亡;Western蛋白印迹法检测内质网应激相关蛋白表达。结果腺苷对EC109细胞生长具有明显的抑制作用。腺苷2 mmol.L-1与EC109细胞作用24,36,48和72 h,细胞存活率分别为(57.7±15.0)%,(56.5±11.1)%,(43.8±5.7)%和(28.8±4.1)%,呈时间依赖性下降(r=0.9192,P<0.01);腺苷0.5,1,2和4 mmol.L-1与EC109细胞作用36 h,随药物浓度增加,细胞存活率依次为(83.1±11.2)%,(67.9±6.7)%,(55.3±5.0)%和(45.4±5.4)%,呈浓度依赖性降低(r=0.8252,P<0.01)。腺苷0.5～4mmol.L-1与EC109细胞作用36 h,细胞凋亡率分别为(15.5±1.1)%,(28.2±0.8)%,(40.1±2.2)%和(50.6±1.3)%,与对照组(2.1±0.3)%相比均明显增加(P<0.05)。腺苷2 mmol.L-1与EC109细胞作用36 h,与正常对照组相比,GRP78、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶3和CHOP表达明显增强(P<0.05,P<0.01),胱天蛋白酶4,胱天蛋白酶3和CHOP发生核易位。GRP78、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶3、CHOP和NF-κB表达呈浓度依赖性增加(rGRP78=0.9471,r胱天蛋白酶4=0.8977,r胱天蛋白酶3=0.968,rCHOP=0.9762,rNF-κB=0.9471,P<0.05)。结论腺苷可诱导人食管癌EC109细胞凋亡,其分子机制可能与内质网应激凋亡途径的启动有关。

沉默单核细胞趋化蛋白-1基因降低人食管癌EC109细胞的迁移及侵袭能力

单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)是白色脂肪细胞分泌的炎症趋化刺激因子,属于趋化因子CC亚族,可促进肿瘤血管形成和细胞外基质降解,从而促进肿瘤细胞的浸润与转移。沉默MCP-1基因可显著抑制恶性肿瘤生长及转移,但其作用的分子机制尚不完全清楚。本研究应用小干扰RNA技术沉默人食管癌EC109细胞中MCP-1表达。细胞划痕试验显示,与对照组相比,沉默MCP-1基因可明显抑制食管癌EC109细胞迁移能力。Transwell侵袭实验显示,沉默MCP-1基因后,EC109细胞侵袭能力降低。Western印迹试验和RT-PCR试验揭示,沉默MCP-1基因后,细胞中MMP-7、MMP-9、TGF-β_1及VEGF表达水平显著下降。研究结果提示,沉默MCP-1基因可通过抑制MMP-7、MMP-9、TGF-β_1及VEGF表达,降低癌细胞迁移及侵袭能力。

食醋干预下大鼠血清对食管癌EC109细胞凋亡及Survivin表达的影响

目的研究长期高醋饮食SD大鼠血清诱导食管癌EC109细胞凋亡及其对Survivin蛋白表达的影响。方法采用普通SD大鼠血清和长期高醋饮食条件下SD大鼠血清培养食管癌EC109细胞。I组:以含20%灭活普通SD大鼠血清培养液培养食管癌EC109细胞;II组:以含20%灭活长期高醋饮食干预条件下SD大鼠血清培养液培养食管癌EC109细胞;应用流式细胞仪分别采用Annexin V-EGFP/PI双染法和亚倍体峰法检测两组食管癌细胞早期和中晚期凋亡率;应用Western blot方法检测Survivin蛋白的表达水平。结果 II组细胞凋亡率明显高于I组,有统计学差异(P<0.05);II组细胞中Survivin蛋白的表达水平明显低于I组,差异有统计学显著意义(P<0.05)。结论长期高醋饮食SD大鼠血清能促进食管癌EC109细胞的凋亡并抑制Survivin蛋白的表达。

冬凌草活性成分KY3对食管癌EC109细胞增殖的抑制作用

目的:探讨冬凌草活性成分KY3对食管癌细胞EC109增殖的抑制作用及其机制。方法:MTT法测定0、10、20、30、40、60、80、100μmol/L KY3对EC109细胞增殖的影响;流式细胞术检测0、10、20、30μmol/L KY3对EC109细胞凋亡和细胞周期分布的影响,免疫荧光法观察KY3对EC109细胞中微管结构的影响,Hoechst 33258染色观察KY3作用后EC109细胞核的形态。结果:KY3能够抑制EC109细胞的体外增殖;KY3处理后EC109细胞周期阻滞在G2/M期并发生凋亡(P<0.05);KY3作用于EC109细胞后,微管遭到破坏,随着KY3剂量的增加,α-微管蛋白逐渐发生降解并出现细胞核固缩、浓染等典型的凋亡形态。结论:冬凌草活性成分KY3在体外对EC109细胞具有增殖抑制作用,其机制可能与破坏细胞微管结构、G2/M期细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡有关。

miR-25对食管癌EC109细胞侵袭和迁移能力的影响及临床意义

目的探索miR-25对食管癌侵袭和迁移能力的影响以及作为食管癌诊断生物标志物的潜力。方法(1)荧光定量PCR(qPCR)检测54例早期食管癌患者癌组织和癌旁组织中miR-25表达水平。(2)人食管癌细胞EC109分为miR-25 mimic组、NC mimic组、miR-25 inhibitor组和NC inhibitor组。转染相应序列后,qPCR检测miR-25转染效率。Transwell实验检测过表达或敲低miR-25对EC109细胞侵袭和迁移的影响。Targetscan数据库预测miR-25的靶基因,选定靶基因盐诱导激酶1(SIK1)基因。Western blot和双荧光素酶报告实验鉴定miR-25与SIK1的靶向关系。(3)EC109细胞分为pcDNA 3.1组、SIK1过表达组和miR-25+SIK1过表达组。Transwell实验检测miR-25靶向SIK1对EC109细胞侵袭和迁移能力的影响。(4)提取食管癌患者(54例)和健康对照者(54例)的血浆外泌体,比较2组血浆外泌体中miR-25的相对表达量,分析食管癌患者癌组织和血浆外泌体中miR-25的相关性。结果(1)食管癌组织中miR-25相对表达水平高于癌旁组织。(2)过表达miR-25后,EC109细胞侵袭和迁移能力增强,而敲低miR-25表达后,细胞侵袭和迁移能力下降。Western blot结果显示,过表达miR-25后,SIK1蛋白表达下降;反之,敲低miR-25后SIK1蛋白表达升高。(3)Transwell实验显示,与pcDNA 3.1组相比,SIK1过表达组EC109细胞侵袭和迁移的细胞数量减少,而miR-25和SIK1联合作用后,EC109侵袭和迁移的细胞数量较SIK1过表达组增多。(4)食管癌血浆外泌体样本中miR-25的表达量高于健康对照,且miR-25在食管癌组织中的表达与血浆外泌体中的相对表达量呈正相关。结论miR-25可能通过靶向调控SIK1来促进食管癌细胞的侵袭和迁移,且miR-25有作为食管癌早期诊断生物标志物的潜力。

桥接整合因子1去甲基化诱导细胞周期阻滞抑制食管鳞状细胞癌EC109细胞增殖

目的:分析桥接整合因子1(bridging integrator-1,Bin1)去甲基化对Bin1基因表达和食管鳞状细胞癌EC109细胞增殖能力的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法:甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)法检测去甲基化药物5-氮杂-2'脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dc)处理后EC109细胞Bin1启动子区域的甲基化状态,用qPCR、Western blotting和MTT法分别检测单独5-Aza-dc和5-Aza-dc加转染Bin1基因干扰片段(Bin1 siRNA)处理对EC109细胞Bin1 mRNA及其蛋白表达和细胞增殖能力的影响,流式细胞术和Western blotting检测5-Aza-dc处理后EC109细胞周期和细胞周期相关蛋白(Cyclin D1与CDK4)表达的变化。结果:去甲基化药物5-Aza-dc处理后,EC109细胞Bin1基因启动子区域发生去甲基化。5-Aza-dc处理的Bin1去甲基化EC109细胞Bin1 m RNA和蛋白表达明显上调(均P<0.05),细胞增殖能力明显下降(P<0.05),细胞阻滞在G0/G1期,表现为S期细胞比例显著减少,细胞周期相关蛋白Cyclin D、CDK4表达均明显下调(均P<0.05)。Bin1去甲基化EC109细胞转染Bin1 siRNA后,Bin1 mRNA和蛋白表达明显下调,细胞增殖能力增强(均P<0.05)。结论:Bin1基因启动子区域在EC109细胞中呈完全甲基化状态,5-Aza-dc去甲基化可使食管鳞癌细胞EC109细胞Bin1表达升高,通过降低细胞周期相关蛋白表达诱导细胞周期阻滞抑制EC109细胞增殖。证实表观遗传学变化可能与食管癌细胞恶性增殖有关,可为食管癌治疗提供新的思路。

大蒜素干预下大鼠血清对食管癌EC109细胞凋亡及Survivin表达的影响

目的研究大蒜素干预下SD大鼠血清诱导食管癌EC109细胞凋亡及其对Survivin蛋白表达的影响。方法Ⅰ组:以普通灭活SD大鼠血清培养液培养食管癌EC109细胞;Ⅱ组:以大蒜素干预SD大鼠灭活血清培养液培养食管癌EC109细胞;采用AnnexinⅤ-EGFP/PI双染法和亚倍体峰法应用流式细胞仪检测2组食管癌细胞早期和中晚期凋亡率;Survivin蛋白的表达应用Western blot方法检测。结果Ⅱ组细胞凋亡率明显高于Ⅰ组,差异有统计学意义(P<<0.05);Ⅱ组细胞中Survivin蛋白的表达水平明显低于Ⅰ组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论长期大蒜素干预下SD大鼠血清能促进食管癌EC109细胞的凋亡并抑制Survivin蛋白的表达。

钒化钠对食管癌细胞系EC109 Caspase-3表达的影响

目的:研究钒化钠对食管癌细胞系EC109 Caspase-3激活的影响,探讨钒化钠影响食管癌细胞系EC109细胞生长的机制。方法:以体外培养食管癌细胞系EC109为研究对象,给予0、0.1、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0μmol/L钒化钠,培养1小时后,用Western blot技术检测食管癌细胞系EC109 Caspase-3激活情况。结果:0、0.1、1.0、5.0、10.0μmol/L钒化钠组培养1小时后,各组Caspase-3蛋白激活与对照组比较均无统计学意义;50.0、100.0、200.0μmol/L钒化钠组培养1小时后,各组Caspase-3蛋白表达均升高。结论:高浓度的钒化钠可能激活EC109细胞Caspase-3蛋白。

食管癌EC109细胞属人类乳头状瘤病毒18型阳性细胞株

目的:探究食管癌细胞系EC109是否为人类乳头状瘤病毒(HPV)感染。方法:以HeLa细胞为阳性对照,以细胞DNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增HPV基因保守序列GP5/GP6基因片段;PCR扩增HPV18 E6和HPV18 E6/E7基因片段;对HPV18 E6/E7 PCR扩增产物片段进行测序;采用逆转录(RT)-PCR扩增HPV18 E6和E7基因片段;利用HPV基因分型芯片对EC109和HeLa细胞进行HPV分型。结果:PCR、RT-PCR和测序结果证明EC109细胞为HPV18阳性细胞;HPV分型芯片结果显示EC109也为HPV18阳性细胞。结论:EC109细胞是属于HPV18亚型感染型细胞。

大蒜素对食管癌EC109细胞生长抑制的实验研究

目的研究大蒜素对食管癌EC109细胞增殖以及凋亡的影响.方法：不同浓度大蒜素处理食管癌EC109细胞后,采用MTT比色法检测大蒜素对EC109细胞增殖的抑制作用;Hoechst33258荧光染色和倒置相差显微镜观察细胞的形态学改变;流式细胞仪检测分析细胞周期分布和细胞凋亡.结果：80μg/ ml大蒜素处理48小时后,相差显微镜以及荧光染色下可见EC109细胞典型凋亡细胞形态学改变.大蒜素对EC109的细胞增殖有明显的抑制作用,且呈时间依赖性,差异有统计学意义（P〈0.05）.20μg/ ml的大蒜素对细胞周期分布没有明显影响.当浓度增加到40μg/ ml时,S期细胞比例明显升高,G0/G1期细胞比例明显减少（P〈0.05）,而G2/M期细胞比例变化不明显.随着大蒜素浓度的增加,细胞凋亡率明显升高（P〈0.05）.结论：大蒜素能明显抑制食管癌EC109细胞的增殖活性,促进细胞的凋亡.

食醋干预下大鼠血清对食管癌EC109细胞增殖活性的影响

目的研究食醋干预下SD大鼠血清对食管癌EC109细胞增殖活性的影响。方法Ⅰ组(对照组)：以含20%灭活普通SD大鼠血清血清培养液培养食管癌EC109细胞；Ⅱ组(实验组)：以含20%灭活长期高醋饮食干预条件下SD大鼠血清培养食管癌EC109细胞；细胞生长曲线、细胞DNA合成以及细胞周期分布应用用MTT比色法和流式细胞术检测。计算各个时间点抑制率、细胞S期分数和增殖指数；结果2组间不同时间点OD值有显著差异性，有统计学意义(P<0.05)。2组不同时间点抑制率的统计分析结果显示差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅰ组细胞G0/G1期细胞比例低于Ⅱ组，而S期及G2/M期细胞所占的比例明显高Ⅱ组；Ⅱ组S期分数及细胞增殖指数显著低于Ⅰ组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论长期高醋饮食干预条件下SD大鼠血清能抑制食管癌EC109细胞的生长以及DNA合成。食醋对食管癌EC109细胞的增殖具有明显的抑制作用。

靶向GRP78的miRNA表达载体对人食管癌EC109细胞增殖的抑制作用

目的:探讨靶向葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)基因的miRNA真核表达质粒,对人食管癌EC109细胞增殖的影响。方法:设计合成4对针对GRP78的特异性miRNA干扰序列和1对阴性对照序列,定向克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体上,构建靶向GRP78的miRNA重组质粒:pcDNATM6.2-miR78-1、pcDNATM6.2-miR78-2、pcDNATM6.2-miR78-3、pcDNATM6.2-miR78-4,并通过脂质体法转染至HEK293细胞;杀稻瘟菌素筛选2周形成稳定转染细胞系;荧光显微镜检测转染效率。将筛选出的最佳干扰质粒转染至EC109细胞,采用RT-PCR法检测GRP78 mRNA的表达,CCK8法检测其对EC109细胞增殖的影响。结果:测序结果表明成功构建4种靶向GRP78的miRNA重组质粒,经转染和筛选,所有转染后HEK293细胞均有GFP的表达;与未转染组及阴性对照组(pcDNATM6.2-Ctrl)相比,4种干扰质粒组HEK293细胞中GRP78 mRNA的表达均下降(P<0.05);干扰效率以转染pcDNATM6.2-miR78-1为最高。pcDNATM6.2-miR78-1转染EC109细胞,与未转染组、pcDNATM6.2-Ctrl组相比,EC109细胞中GRP78 mRNA的表达明显下降[(0.38±0.02)vs(1.03±0.04)、(1.00±0.03),均P<0.05]。CCK8法检测结果显示,转染pcDNATM6.2-miR78-1干扰质粒12、24、48、72 h后,EC109细胞的增殖被显著抑制[(0.028±0.001)vs(0.086±0.010),(0.035±0.003)vs(0.155±0.011),(0.112±0.009)vs(0.389±0.008)、(0.169±0.013)vs(0.433±0.009);均P<0.05]。结论:4对靶向GRP78的miRNA表达载体构建成功,其中pcDNATM6.2-miR78-1干扰质粒沉默效果最佳,能有效抑制EC109细胞的增殖。

PUMA在紫檀芪诱导食管癌EC109细胞凋亡中的作用

目的:探讨紫檀芪(pterostilbene,PTE)对人食管癌EC109细胞活力及凋亡的影响,并明确p53上调凋亡调控因子(p53 upregulated modulator of apoptosis,PUMA)在其中的作用。方法:不同浓度PTE(0、50、100、150μmol/L)分别处理EC109细胞,cell counting kit-8(CCK-8)法检测各组细胞活力;Annexin V-FITC/PI染色检测各组细胞凋亡;Caspase-3活性检测试剂盒检测各组细胞Caspase-3活性;荧光探针DCFH-DA检测各组细胞内活性氧(ROS)水平;Western blot检测各组PUMA蛋白的表达。Control siRNA和PUMA siRNA分别转染EC109细胞后,PTE(0、100μmol/L)处理细胞24h,Western blot检测各组PUMA蛋白的表达,CCK-8法检测各组细胞活力。结果:EC109细胞经不同浓度PTE(0、50、100、150μmol/L)分别处理12、24、36h,可有效抑制EC109细胞活力,并呈浓度时间依赖性(P<0.01)。上述浓度PTE处理24h,还可以显著增加EC109细胞凋亡率、Caspase-3活性和ROS水平(P<0.01)。siRNA干扰EC109细胞PUMA蛋白表达后,PTE对EC109细胞的活力抑制作用减弱(P<0.01)。结论:PTE可降低食管癌EC109细胞活力,其机制与激活PUMA介导的细胞凋亡通路有关,PTE可能在食管癌的药物治疗领域具有广阔的应用前景。

黄芪多糖诱导细胞自噬抑制食管癌EC109细胞增殖的研究

目的研究黄芪多糖(APS)对食管癌EC109细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响及其与细胞自噬的关系。方法体外培养EC109细胞,实验分为以下几组:浓度为0(对照组)、1.0、1.5、2.0 mg·mL^(-1)的黄芪多糖组,5μmol·L^(-1) PIK-Ⅲ(自噬抑制剂)组,2.0 mg·mL^(-1)黄芪多糖联合5μmol·L^(-1) PIK-Ⅲ组。采用MTT法检测各组EC109细胞的增殖活性;吖啶橙染色实验和流式细胞术检测黄芪多糖组细胞的凋亡;扫描电镜观察黄芪多糖组EC109细胞表面结构的变化;Transwell细胞迁移、侵袭实验分别检测黄芪多糖组EC109细胞的迁移和侵袭能力;激光共聚焦显微镜检测黄芪多糖组LC3的荧光表达强度;Western blot检测黄芪多糖组自噬相关蛋白Beclin1、P62和LC3B的表达水平。结果与对照组相比,随着黄芪多糖浓度的升高,EC109细胞增殖抑制率及凋亡率显著增加;细胞表面结构破坏程度增加;细胞迁移和侵袭能力受到显著抑制;LC3荧光表达强度增强(P<0.01);P62蛋白表达水平显著降低(P<0.01),Beclin1和LC3B表达水平显著增高(P<0.05,P<0.01)。结论黄芪多糖可浓度依赖性地抑制EC109细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进EC109细胞的凋亡,其机制可能与黄芪多糖诱导EC109细胞自噬有关。