猪ETECK88ac、K99黏附素蛋白生物信息学分析及多表位疫苗载体构建

由猪产肠毒素大肠杆菌(ETEC)引起的仔猪腹泻是规模化猪场最常见的疾病之一。目前国内和国际上制备ETEC疫苗的靶基因多为其黏附素基因K88ac、K99。本试验通过分析ETEC K88ac、K99黏附素蛋白的生物学信息,将抗原表位进行组合,设计了一种同时含有K88ac、K99基因的多表位重组疫苗载体。首先应用ProParam、SOPMA和GOR软件分析K88ac、K99蛋白的理化特性及二级结构,应用IEDB与ABCpred软件预测二者的B细胞抗原表位,应用RANKPEP软件预测Th细胞表位,应用IEDB与NetMHC-4.0软件预测CTL细胞表位;然后将预测的B细胞、Th细胞和CTL细胞抗原表位加上接头序列,按照一定顺序进行组合,分别设计多表位连接多肽Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ;最后通过分析抗原性、致敏性,筛选抗原性最强的连接多肽,并对其进行表征。结果显示:共筛选出9个抗原表位,按照不同的排列组合获得了3种连接多肽,其中连接多肽Ⅱ抗原性最强,为0.906 8;应用AllerTOP v. 2.0在线工具对连接多肽Ⅱ进行过敏性预测,发现其没有过敏性;应用ZpGJn4在线工具对连接多肽Ⅱ进行三维建模,发现其结构表位暴露性较好,易与抗体结合,在蛋白分子构象上符合表位设计要求。将该多表位肽的氨基酸序列按照乳酸菌密码子嗜好性反向翻译为核苷酸序列,随后插入pET28a载体中获得了p ET28a-KT质粒。结果表明,构建的连接多肽Ⅱ适合作为多表位疫苗的备选载体蛋白。多表位肽的设计及pET28a-KT质粒的获得为下一步构建表达ETEC多表位抗原的重组乳酸菌提供了技术支撑。

不同猪种肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4受体微卫星标记遗传差异性研究

采用13号染色体上与K88ab和K88ac受体基因连锁的2对引物(S0223和S0068),研究沙子岭猪和大约克猪的遗传差异性。结果表明,2个猪种在2个基因座均存在多态性,其基因杂合度和Shannon信息指数存在很大差异,而中外猪种的K88ab和K88ac受体基因也存在遗传差异,这2对引物可望作为K88ab和K88ac受体基因的遗传标记。

陕西省致仔猪腹泻ETEC的分子流行病学调查

【目的】对陕西省致仔猪腹泻产肠毒素大肠埃希菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)的肠毒素及黏附素进行分子流行病学调查。【方法】采集陕西省陕北(子洲、甘泉)、陕南(汉中、城固)和关中(杨凌、西安、户县)3个地区7个大型养猪场1～50日龄腹泻仔猪的粪便样品,进行大肠埃希菌的分离与鉴定。采用普通和多重PCR方法,检测已知能表达毒素的大肠埃希菌标准菌株,以验证试验方法的可行性;采用多重PCR方法,对分离自陕西省腹泻仔猪粪便样品中的大肠埃希菌进行肠毒素(STa、STb、LT)和黏附素(K88、K99、987P、F41)检测。【结果】试验共分离鉴定出104株大肠埃希菌,其中表达肠毒素的菌株有45株,STa、STb、LT和STa+LT阳性的菌株数量分别为28,5,8和4株;表达黏附素的共31株,K88、K99、987P和K88+987P阳性的菌株分别为4,22,2和3株。在被检测的样品中,同时表达肠毒素和黏附素的大肠埃希菌有14株;陕南地区仅检测出STa肠毒素和K99黏附素,陕北地区较复杂,各毒素类型均有出现。在1～7日龄,致仔猪腹泻大肠埃希菌表达的毒素主要是K99和STa;到20～30日龄时,各种毒素均有不同程度检出。【结论】陕西省致仔猪腹泻ETEC表达的肠毒素主要是STa,表达的黏附素主要是K99;毒力因子的分布与区域和仔猪日龄有密切关系。

不同猪种肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4受体的微卫星标记遗传效应分析

从猪13号染色体选取与Escherichia coli F4受体基因连锁的4个微卫星座位研究不同猪种间的遗传特性，并分析不同基因型与F4受体黏附表型的关系。结果表明，4个猪种在4个基因座均具有高度多态性，杂合度（H）在0．6117-0．7500之间，多态信息含量（PIC）达0．5749以上。微卫星座位S0222不同基因型对沙子岭猪F4ab血清型黏附表型影响显著;SW458座位AC基因型在沙子岭、大白两个品种中无黏附表型，可望作为对E．coli F4抗性基因的遗传标记。

牦牛ETEC灭活疫苗的研制及免疫效力试验

制备了耗牛ETEC铝胶灭活苗、油佐剂苗和蜂胶灭活苗。分别使用 3种佐剂灭活苗进行对比试验。经抗体监测表明在免疫后 7天 ,蜂胶苗产生的抗体效价最高 (2 7) ,随着时间的推移 ,油苗抗体效价最高 (2 9～ 10 ) ,于免疫后 2 9日 ,使用ETEC进行攻毒 ,免疫兔全部保护 ,对照兔全部死亡。证明牦牛ETEC3种佐剂灭活疫苗均能有效保护家兔免受ETEC攻击。

ETEC肠毒素基因多重PCR检测方法的建立

肠毒素性大肠杆菌的致病性与其具有粘附性的菌毛和产肠毒素的能力密切相关。由于菌毛的血清型多而复杂 ,肠毒素只有不耐热肠毒素 (LT)和耐热肠毒素 (ST)两种 ,因此成为研究的对象。用三对扩增产物分别为 1 1 0bp、2 37bp、368bp的引物建立了检测LT和STⅠ、STⅡ毒素基因的多重PCR方法。扩增产物分别用HindⅢ、HincⅡ、Sau3AⅠ限制性内切酶酶切 ,均得与预期一致的 2个片段。对各个参考株的检测结果为 1 0 0 %符合。结果表明该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性。

产毒性大肠杆菌(ETEC)中毒力岛分布的研究

目的 了解小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性大肠杆菌中的分布，以便于进一步深入研究毒力岛在大肠杆菌中的结构的完整性和功能。方法ＰＣＲ扩增和原位杂交及基因序列分析。结果 在检测的９３株产毒性大肠杆菌（ＥＴＥＣ）的毒力岛的检出率为 ３２．２５％（３２／９３），而且这些阳性菌株中的毒力岛大部分连接到 ａｓｎｔＲＮＡ（天门冬氨酸ｔＲＮＡ）位点。结论 产毒性大肠杆菌是致病性较强的病原菌之一，而小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性大肠杆菌中阳性率较高的分布．

ETEC K99、K88菌毛蛋白抗原表位多肽的设计合成及免疫反应

目的:通过生物信息学及蛋白分析软件等,寻找ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位。方法:通过生物信息学技术、DNAStar Protean蛋白分析软件及网络共享软件对ETEC K88、K99菌毛蛋白抗原性相关的参数进行预测分析,从而设计ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位多肽;采用腹腔注射的方式将合成的抗原表位多肽免疫小鼠,用ELISA法检测血清中产生的抗体,并对免疫小鼠进行了攻毒试验。结果:多肽免疫小鼠后均能诱导抗体产生,攻毒试验表明合成肽对小鼠具有保护作用。结论:成功预测了抗原表位,合成的表位多肽具有较好的抗原性。

ETEC破坏肠上皮细胞紧密连接作用的研究进展

动物肠腔内存在大量共生菌,这些细菌大部分有助于肠道功能的维持与健康[1]。然而,病原菌进入肠道就会引起感染,肠道病原菌与宿主上皮细胞的相互作用多与毒素相关。产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)是农场动物大肠杆菌性腹泻最常见的病原菌。ETEC的致病性始于对宿主小肠上皮细胞的粘附,随之而来的是肠毒素的分泌,引发急性水样腹泻,伴随着炎症和屏障功能的破坏。

纯化ETEC K88菌毛特异性卵黄抗体的加工贮藏及体外抗粘附性研究

分离、纯化产肠毒素大肠杆菌(ETEC) K88ac菌毛蛋白,将其免疫产蛋鸡,经喷雾干燥制备抗ETEC菌毛抗原特异性卵黄抗体粉。间接ELISA法检测卵黄抗体效价,试验结果表明,喷雾干燥(140℃进气,65℃出气)对卵黄抗体活性无影响,加工前后抗体滴度均为1∶1280;卵黄抗体粉在90℃干热条件下处理5min后抗体效价下降50%,而90℃湿热条件下处理5min抗体效价无明显变化,但处理15min后下降75%;经过1h的干热或湿热处理,抗体均基本失活;4℃和常温下放置半年对卵黄抗体粉活性无影响;体外抑制粘附试验表明,抗K88卵黄抗体能抑制K88对肠上皮细胞的粘附。

ETEC菌毛蛋白K99抗体PPA-ELISA检测方法的建立及初步应用

以纯化的大肠埃希菌K99菌毛蛋白为包被抗原,建立检测大肠埃希氏菌K99 Ig G抗体的间接ELISA方法。确定间接ELISA的最适反应条件,即抗原包被的ELISA板4℃过夜,最适抗原包被浓度为4.94μg·m L-1,兔抗体稀释倍数为1:50,猪抗体稀释倍数为1:200,确定最佳封闭液为100 g·L-1脱脂奶粉,最佳封闭时间为0.5 h,血清反应时间为1 h,二抗最适浓度梯度为1:2000,反应时间为37℃0.5 h,底物室温反应时间为37℃10 min,阴阳性临界值兔血清为0.25、猪血清为0.35。试验证实该间接PPA-ELISA方法的特异性强、敏感性高、重复性好,可以为疫苗效力检验和流行病学调查提供参考方法。

猪肠毒性大肠杆菌(ETEC)病抗病育种研究

猪肠毒性大肠杆菌 (ETEC)是仔猪黄痢、白痢等腹泻疾病的主要病原菌 ,发病率和死亡率分别占总发病率和死亡率的 5 6 .2 %和 2 4 .7%。按其特异菌毛产生的粘附素不同有 K88、K99、987P等多种类型 ,K88又可分为 ab、ac、ad血清型 ,现已知 ETEC K88能否致病 ,取决于宿主小肠粘膜上皮细胞刷状缘有无受体 ,并受制于 1对等位基因 ,有受体 (敏感型 )为显性 (S) ,无受体 (抗性型 )为隐性 (s)。该位点位于 1 3号染色体长臂 3.1区段 ,与转铁蛋白 (Tf)连锁 (相距7.4 c M) ,且 Tf基因频率与 K88抗性存在一定关系 ,抗性型与敏感型的小肠粘液理化性质也存在差异 ,据此 ,有可能采用生化及分子生物技术筛选抗性遗传标记 ,开展抗病育种。

大肠杆菌ETEC 987P菌毛蛋白重组干酪乳杆菌的构建

产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）是引起仔猪腹泻的主要病原菌之一，给我国乃至全世界的养猪业带来了巨大的经济损失。黏附素性菌毛的黏附作用是该菌致病的先决条件[1]。目前，该病的防治主要以药物和疫苗为主，但由于药物的治疗价格昂贵，并且病原菌容易产生耐药性，因此免疫预防成为治疗该病的最佳选择[2]。目前，国内外主要采用灭活苗预防和控制该病，但灭活苗的生产费用比较高，需要佐剂辅助，而且免疫原性较差。此外，灭活苗仅能诱发体液免疫应答，不能产生细胞免疫应答和局部免疫应答；因此，这就迫使我们研制一种安全、有效的新型疫苗来预防该病。

一起学校水型ETECO_6K_(15)致感染性腹泻暴发的调查

2003年9月8～16日,本区某职业学校学生中,发生一批以腹泻为主要症状的患者,经现场流行病学调查、临床和实验室检查,证实这是一起饮用污染O6K15型产毒素性大肠埃希菌(ETEC)水源所致感染性腹泻暴发,现将调查结果报告如下.

应用DNA探针首次检出西藏高原地区ETEC—LT

产毒性大肠杆菌(ETEC)是引起感染性腹泻的一个重要病原菌。它产生两种肠毒素即LT和ST。80年代前后曾采用兔肠段结扎法和免疫溶血法等生物学、免疫学方法检测产毒性大肠杆菌(ETEC—LT)。国内于1986年报导了LT—DNA基因探针技术用于ETEC—LT的检测,并取得较好结果。

平板免疫溶血与基因探针试验检测ETEC中LT的比较研究

产毒性大肠杆菌(ETEC)是人和家畜感染性腹泻的重要病原菌。它产生两种肠毒素:热稳定肠毒素(ST)和热敏感肠毒素(LT)。后者有多种检测方法,包括经典的兔肠结扎、组织培养、皮肤试验以及近来的 SPA 协同凝集法,固相放射免疫、ELISA 等。国内学者杨氏根据 Evans 的被动免疫溶血试验原理结合自己的实际工作创建了平板免疫溶血试验(PIHT),取得了较好的效果。但该法需高质量的特异性抗体,最近北京302医院制备 LT-McAb。

抗F41-McAb在体外对ETEC·F41菌粘附肠上皮细胞的阻断作用

本文用ETEC·F41菌株及抗F41-McAb进行了体外肠上皮细胞粘附试验及粘附阻断试验,结果表明F41菌株不仅可粘附于天然宿主(牛)的小肠上皮细胞上,也粘附于BALB/c小鼠的小肠上皮细胞上,其宿主特异性是相对的。F41-McAb粘附阻断试验证明F41-McAb有很高的特异性,能有效地阻断菌株对肠上皮细胞的粘附作用,而不阻断其它肠道菌的粘附;并证实,抗F41-McAb 1F6、2C5、3B6为菌毛粘附位点的McAb,而1H5、4E11则是针对非粘附位点的决定簇,提示若以F41-McAb用于防治急性腹泻或F41疫苗生产质控时,应选用1F6、2C5或3B6-McAb。

适用于蛋鸡免疫的猪源ETEC菌毛蛋白佐剂的筛选

为筛选卵黄抗体的优良佐剂,以3株猪源致病性大肠杆菌(ETEC)菌毛蛋白为模式抗原,分别与6种佐剂制备多价菌毛蛋白疫苗,免疫海兰褐壳蛋鸡。结果显示,3次免疫后,所有试验组蛋鸡产蛋率均有不同程度下降,但SPA、ISCOMs、弗氏佐剂、蜂胶佐剂组的产蛋率下降程度较为轻微;对鸡体血清抗体和制备获得的卵黄抗体的效价检测结果均显示:SPA和ISCOMs组虽较SPB、SPC、弗氏佐剂组抗体水平略低,但持久度较好,且通过对蛋鸡外观形态和注射部位组织变化情况的观察显示,两者不会刺激鸡体热反应或炎症反应,无任何表观副作用。因此,更适合作为蛋鸡制备猪源ETEC卵黄抗体的优良佐剂。