大豆GmWRI1a基因克隆及生物信息学分析

利用Phytozome数据库、NCBI网站等软件对大豆(Glycine max)基因组中WRI1同源基因进行生物信息学分析,发现大豆WRI1转录因子有2个拷贝,分布在第8和15号染色体上。以大豆未成熟种子cDNA为模板,克隆15号染色体WRI1转录因子的cDNA全长序列,命名为GmWRI1a。应用生物学软件发现,GmWRI1a蛋白含有2个AP2/EREBP结构域(60-225)。进化树分析表明,GmWRI1a包含在第一个分支里,与AtWRI1距离较近,推断其与AtWRI1属于同源基因,具有相似的功能。对与GmWRI1a蛋白存在相互作用的蛋白进行预测分析,发现与其相互作用的蛋白多数参与糖降解或质体脂肪酸合成,结果表明,GmWRI1a转录因子可能在控制种子发育中时从糖到油的碳流动中起重要作用。

大豆转录因子GmWRI1基因的分离及其转录激活特性分析

为探讨大豆转录因子GmWRI1在大豆种子油脂形成过程中的调控作用,本研究从大豆吉育72花后35d的种子中克隆得到GmWRI1全长cDNA序列,并对该基因编码的蛋白的理化性质、结构功能进行了初步分析;通过实时荧光定量PCR对花后不同时期籽粒中GmWRI1进行定量分析并对种子进行油脂含量的测定,推测GmWRI1的表达量可能与大豆籽粒中油脂含量有关。此外,利用重组DNA技术构建酵母表达载体pGBKT7-GmWRI1并转入AH109酵母菌株中,结果表明GmWRI1具有转录激活活性,属于转录激活子。

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及其功能分析

为了探究大豆种子油脂合成与储存基因GmWRI1a的调节,分析其启动子功能,从大豆品种东农50基因组中扩增获得GmWRI1a基因转录起始位点上游1669bp的启动子序列,转化拟南芥。GUS染色确定了启动子的有效性,继而根据顺式作用元件的分布,分别扩增得到4个启动子5'端缺失片段1138bp,1087bp,690bp和437bp。4个启动子缺失片段分别转化拟南芥后,通过GUS组织染色结果发现,这些启动子片段能够驱动下游GUS基因表达。GUS酶活表明,启动子存在乙烯、茉莉酸、赤霉素3种激素响应元件,其中乙烯、茉莉酸和赤霉素的响应元件分别分布在-1138^-1087bp、-1087^-690bp和-690^-437bp。

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及序列分析

以大豆基因组文库Phytozome公布的大豆Williams82基因组序列为参考,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,用PCR技术扩增了大豆GmWRI1a基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGM-TpGmWRI1a,并通过PCR扩增对阳性克隆进行鉴定送测序。克隆获得GmWRI1a基因启动子序列1 686bp,该启动子序列除含有必需的起始转录位点、TATA-box、CTTA-box外还包含多个顺式作用元件,如光应答元件、赤霉素应答元件、表达分生组织相关元件、抗旱诱导元件等。同时,构建了该启动子植物表达载体pBI-pGmWRI1a,通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定,为启动子的功能研究奠定基础。大豆GmWRI1a基因启动子克隆与序列分析,将为进一步研究大豆GmWRI1a基因的表达调控及其功能分析提供参考。

大豆GmWRI1基因在糖、植物激素及盐胁迫下的表达分析

大豆是我国重要油料作物之一,提高大豆的产油量一直是大豆育种的重要方向。WRIN-KLED(WRI)作为AP2/EREBP家族的一个转录因子,在油脂合成过程中参与油脂合成和积累。2014年对大豆东农47进行葡萄糖(Glucose)、蔗糖(Sucrose)、赤霉素(gibberellin A3,GA3)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、盐(Na Cl)等外源处理,分析不同处理Gm WRI1基因的表达。研究表明,Gm WRI1基因受葡萄糖、赤霉素、ABA信号诱导,为这3种信号途径中的正向调控因子;在蔗糖、氯化钠处理中,Gm WRI1基因表达量下调,为蔗糖、盐胁迫中的负调控因子。为后续深入研究大豆油脂合成调控提供一定的理论基础。