梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd基因的克隆、表达及其免疫活性研究

利用PCR技术从Tp Nichols株基因组模板中扩增梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)外膜蛋白Gpd基因,定向克隆构建真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd,免疫印迹和免疫组化技术检测pcDNA3.1(+)-Gpd在HeLa细胞中的表达;同时将真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd免疫新西兰兔,检测其在兔体内的免疫应答效果。免疫印迹和免疫组化鉴定均显示重组体在HeLa细胞中能有效表达一个41kD的Gpd融合蛋白。新西兰兔接种核酸疫苗后,能产生特异性抗体,第3次免疫后2周抗体最高滴度可达1∶1024,免疫后兔脾细胞受Gpd蛋白刺激有明显增殖反应。所诱导的抗体水平和脾淋巴细胞增殖情况均显著高于空质粒对照组和空白对照组(p<0.05)。Tp真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd的成功构建及能刺激新西兰兔产生较强特异的免疫应答,为Gpd蛋白生物学功能及梅毒DNA疫苗的深入研究奠定了一定的实验基础。

立枯丝核菌不同融合群菌株GPD基因的克隆及序列特征分析

利用同源克隆的方法对11个立枯丝核菌标准融合群菌株的GPD基因进行了分离。分析发现不同融合群立枯丝核菌GPD基因在外显子数目、编码蛋白长度及内含子剪切方式等方面存在差异,如AG-2-2ⅢB、AG-2-2Ⅳ、AG-8三个融合群的GPD基因的外显子个数为10个,其他融合群均为11个;AG-8融合群的GPD基因的编码蛋白长度为267个氨基酸,其余融合群的GPD基因的编码蛋白长度约为340个氨基酸。AG-2-2ⅢB、AG-2-2Ⅳ、AG-8三个融合群的GPD基因在98、98、272氨基酸位点的内含子发生了缺失。基于蛋白序列的进化分析表明不同融合群之间GPD基因编码蛋白存在明显差异,可以有效地将不同融合群菌株区分开来;同时,不同物种之间GPD基因在进化上仍具有一定保守性,立枯丝核菌自身的GPD基因蛋白序列归为一类且与担子菌门同源性最高。这些结果表明进行保守基因序列差异分析是进行立枯丝核菌分类分群研究的新思路。

基于gpd基因的大蒜黑腐病菌实时荧光定量PCR鉴定技术

【目的】大蒜黑腐病菌(Embellisia allii(Campanile)Simmons)的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长,而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似,极难分辨,需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)体系以准确、灵敏地鉴定大蒜黑腐病菌。【方法】从NCBI的Gen Bank数据库中,选取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似种的3-磷酸甘油脱氢酶(gpd)基因核酸序列数据15种,应用引物设计软件Primer express,根据探针设计原则从理论上选出1条探针和3对引物。根据试验结果对上述引物进行筛选,筛选出能够鉴定出大蒜黑腐病菌的特异性引物对和Taq Man探针。同时对反应体系中复性-延伸温度的反应参数进行优化,设计56、58、60℃3个温度梯度;将大蒜黑腐病菌基因组DNA在紫外核酸分析仪上进行定量后进行10倍的梯度稀释,对探针灵敏性进行测试,从而建立大蒜黑腐病菌Taq Man水解探针法q PCR检测体系。【结果】从基于Gen Bank上的15种gpd基因核酸序列设计的引物和探针中,筛选出能够鉴定大蒜黑腐病菌的特异性引物对Emb21/Emb32和Taq Man探针Emb。在供试的6种菌株中,只有靶标菌大蒜黑腐病菌利用该引物对和探针能够被特异性的检测到阳性,空白对照和其他参试菌均没有荧光信号的增加,检测为阴性。复性-延伸温度反应参数优化中,△Rn荧光信号增加值在58℃时达最大,56、60℃荧光信号增加值降低,经过多次重复试验,确定最佳的复性-延伸温度为58℃。灵敏度测试中,大蒜黑腐病菌DNA浓度稀释到140 pg时,所得的图形较好;当体系中模板浓度稀释到14 pg时,所得的图形较差。最终DNA检测灵敏度为140 pg。应用该引物和探针建立的q PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出大蒜黑腐病菌。【结论】建立了大蒜黑腐病菌Taq Man探针法q PCR检测体系,该检测技术能够从供试的6种病原菌中特异性检测出大蒜黑腐病菌,检测灵敏度可达140 pg。建立的基于gpd基因的大蒜黑腐病菌q PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,适合口岸大蒜黑腐病菌的快速检测。

桦褐孔菌GPD基因cDNA序列和启动子的克隆与分析

利用RACE和染色体步移技术首次从桦褐孔菌中克隆得到三磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)基因和启动子序列。桦褐孔菌GPD基因的cDNA序列全长1223 bp,其中,编码区1020 bp,共编码339个氨基酸,相对分子质量约为36.39 kDa,理论等电点为8.28。序列比对结果表明:桦褐孔菌GPD基因与鲍姆桑黄(Sanghuangporusbaumii)相似度为88%。利用染色体步移技术方法克隆得到GPD基因起始密码子上游446 bp启动子序列,分析表明在152 bp和160 bp处有2个转录起始位点,含有TATA、CAAT、CCAAT box及重要顺势作用元件LTR、O2-site、circadian、Sp1、TCCC-motif等,这将为桦褐孔菌菌株的分类鉴定、功能研究及高效表达载体的建立提供基因资源。

梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd的基因型分析及其重组蛋白的免疫原性鉴定

目的 构建梅毒螺旋体 (Treponemapallidum ,Tp)外膜蛋白Gpd基因的原核表达载体 ,检测其表达产物的免疫原性 ,并比较梅毒螺旋体各菌株Gpd基因序列的同源度。方法 从TpNichols株基因组模板中PCR扩增Gpd基因 ,与GenBank登录的序列做blast比较 ,定向克隆构建原核表达重组体pET2 8b( + ) -Gpd ,转入大肠杆菌ril表达菌 ,SDS -PAGE分析重组蛋白的表达 ,Western -blot检测重组蛋白的免疫原性。结果 载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的Nichols株Gpd基因序列完全一致 ,同其他病原性密螺旋体菌株登陆序列比较同源度为 98%～ 1 0 0 %。SDS -PAGE检测诱导产物显示有一Mr约为 41kDa的特异蛋白带 ,免疫印迹技术检测其能与梅毒阳性标准血清反应。结论 Tp原核表达重组体pET2 8b( + ) -Gpd成功构建 ,且能够在ril表达菌中融合表达 ,为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了一定的实验基础。

梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd在Hela细胞中的表达及鉴定

目的构建梅毒螺旋体(Tp)外膜蛋白甘油磷酸二酯磷酸二酯酶基因(Gpd)的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gpd,鉴定其在Hela细胞的表达,为开展Tp DNA疫苗动物实验打下基础。方法用PCR从Tp Nichols株基因组中扩增Gpd基因,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gpd,脂质体介导转染入Hela细胞,以免疫组化及Western-blot检测在Hela细胞中的表达。结果双酶切及DNA测序显示重组质粒含有1 059 bp的目的基因片段,读码框架正确,无突变。该重组质粒在Hela细胞能有效表达分子量为41 kDa的目的蛋白,重组蛋白能与梅毒螺旋体阳性血清反应。结论构建的质粒pcD-NA3.1(+)-Gpd成功地在体外真核细胞中表达。

金针菇启动子的基因克隆

利用PCR扩增技术,以金针菇菌丝总DNA为模板,扩增出一条长约750 bp的特异性gpd启动子基因条带(命名为gpd-Fv2),并将其连接到载体上,然后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选出阳性质粒。DNA序列与金针菇gpd启动子的同源性为98%。

黄伞菌株中三磷酸甘油醛脱氢酶基因片段的分离鉴定与保守性验证

本研究以黄伞菌丝cDNA为模板,设计简并引物,经PCR扩增出两条片段SL1和SL2,经过回收、重扩增、克隆与鉴定后进行测序分析,结果发现SL1的序列在Genebank中与三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease,GPD)基因的同源性达到85%,根据SL1序列设计引物,以黄伞菌丝体、原基、菇蕾、子实体菌柄、子实体菌盖的cDNA为模板进行PCR反应以验证其保守性,结果显示此片段在不同分化发育阶段表达量相同。

我国桔梗上一种新病害匍柄霉叶斑病的病原

2013年在内蒙古赤峰市喀喇沁旗发现桔梗匍柄霉叶斑病,该病害在2014–2017年均再次发生。采用单孢分离法在病叶上得到病原菌,于PCA培养基上培养后,在光学显微镜下观察记录病原菌形态学特征。同时将病原菌的rDNA ITS、gpd和EF-1α的PCR产物测序后做BLAST分析。结果表明该菌与桔梗匍柄霉Stemphylium platycodontis基本一致。这是国内桔梗匍柄霉叶斑病的首次详细报道。