HSV-tk基因和IL-12基因抑制VEGF的表达及对鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放射增敏作用的实验研究

目的:研究HSV-tk基因和IL-12基因抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达对鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放射增敏作用。方法:建立鼻咽癌荷瘤裸鼠模型,将42只成瘤鼠随机分成IL-12组、IL-12+放射治疗组、HSV-tk/GCV组、HSV-tk/GCV+放射治疗组、IL-12+HSV-tk/GCV组、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组、空白对照组、每组6只。采用瘤内注射分别给予相对应的重组腺病毒液(AdKDR-tk)、重组逆转录腺病毒液IL-12及生理盐水,24 h后重复注射1次。次日起HSV-tk/GCV组、HSV-tk/GCV+放射治疗组、IL-12+HSV-tk/GCV组、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组连续10 d每天腹腔内注射GCV 100 mg/(kg·d),连续10 d。各放射治疗组第3周开始给予6MV-X照射,每天2 Gy,连续5 d。治疗结束后处死裸鼠,检测裸鼠肿瘤质量及肿瘤生长抑制率,免疫组织化学法检测肿瘤微血管密度及VEGF阳性细胞灰度值。结果:IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组裸鼠瘤体质量明显低于IL-12组、IL-12+放射治疗组、HSV-tk/GCV组、HSV-tk/GCV+放射治疗组,差异均有统计学意义(P<0.05)。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组的肿瘤生长抑制率最高,达71.7%。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组微血管密度均低于其他各组,VEGF阳性细胞灰度值均高于其他各组(P<0.05)。结论:HSV-tk基因和IL-12基因联合应用在鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放疗中可抑制移植瘤的生长,为鼻咽癌的放疗产生增敏作用。

CD-TK和HSV-TK两种自杀基因体系对前列腺癌细胞的杀伤作用

背景与目的:自杀基因治疗是一种有前景的基因治疗方法,本实验通过观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-TK)和CD-TK两种自杀基因体系对前列腺癌细胞PC-3m的杀伤效果,探讨该基因治疗在前列腺癌治疗中的应用价值。方法:应用逆转录病毒载体将HSV-TK基因和CD-TK融合基因分别转染PC-3m细胞,经RT-PCR鉴定后,MTT法检测丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)、5-氟胞嘧啶(5-flucytosine,5-FC)前体药物单一或联合应用对转染后PC-3m细胞的杀伤作用,以未转染的PC-3m细胞作对照。结果:GCV对转染后PC-3m细胞有较强的细胞毒作用,半数抑制浓度为8.34μg/ml,但旁观者效应不明显;5-Fc则有显著旁观者效应,当混育细胞中转染细胞比例是5%时即可出现;联合用药具有协同作用,两药相互作用指数小于1.0。结论:CD-TK自杀基因体系对前列腺癌细胞具有显著杀伤作用,明显优于单用HSV-TK基因体系,深入研究意义较大。

大鼠肝癌细胞HSV-tk/GCV自杀基因系统的构建及其旁观者效应

目的:构建针对大鼠肝癌细胞的HSV-tk/GCV(以下简称tk/GCV系统)自杀基因治疗系统,建立比较tk/GCV系统作用效果及其旁观者效应大小的细胞模型和检测方法.方法:用包装细胞PT67/tk分泌的重组逆转录病毒的活性颗粒感染大鼠肝癌CBRH7919细胞,用G418筛选3wk获得高耐药性的重组子CBRH7919/tk,扩大培养.提取CBRH7919(tk-),CBRH7919/tk(tk+)细胞的DNA,把HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后,与2种DNA及阳性对照DNA进行点杂交,以检测tk+细胞的DNA是否整合有HSV-tk基因.用0.1、1、10、50、100mg/L的GCV体外作用于tk-、tk+细胞,MTT检测存活率.用GCV体外分别作用于含不同比例tk+细胞的tk+、tk-混合细胞,MTT检测存活率,比较分析各组旁观者效应大小,确定后续实验的合适tk+比例.结果:用G418筛选3wk后获到高耐药性的CBRH7919/tk(tk+)重组细胞.HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后进行点杂交,检测到tk+细胞DNA上已整合有HSV-tk基因,而tk-细胞DNA不含HSV-tk基因.GCV对tk+细胞生长抑制和细胞毒作用明显,而且有浓度、时间依赖性,而tk-细胞对GCV不敏感,说明HSV-tk基因已表达且表达产物具有生物学活性.GCV对含5%和10%tk+的混合细胞杀伤率分别为6.0%和25.2%,结果表明5-10%的tk+混合比例下自杀基因系统自身的旁观者效应较低,而且用MTT检测旁观者效应大小时灵敏度比较高,可作为后续研究中药活性成分对旁观者效应增效作用的tk+、tk-混合比例.结论:成功构建了针对大鼠肝癌的HSV1-tk/GCV自杀基因治疗系统,建立了体外快速筛选旁观者效应增效药物的稳定有效的细胞模型和检测方法.

逆转录病毒介导HSV-TK基因治疗膀胱癌及旁观者效应的观察

目的 观察HSV TK/GCV治疗膀胱癌的体内效果及旁观者效应。方法 用逆转录病毒感染鼠源性膀胱癌细胞T739,以不同比例的T739和T739TK细胞建立膀胱癌腹腔肿瘤模型 ,同时 ,在背部皮下以母代细胞T739建立皮下肿瘤 ,观察GCV治疗前后肿瘤大小变化及动物存活时间。结果 动物存活时间随基因转移效率提高而延长 ,腹腔肿瘤生长受到抑制 ,背部肿瘤在 5 0 %以上转移效率时肿瘤生长缓慢。结论 HSV TK/GCV对膀胱癌的体内杀伤效应随基因转移效率提高 ,并存在远距离旁观者效应。

HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞的旁观者效应及其机制研究

目的观察HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的旁观者效应并研究其作用机制。方法将转HSV-tk基因HTFs(HTFs-tk)与正常HTFs于两种接种密度下以不同比例混合,加入5μg/m l更昔洛韦作用5 d,MTT法检测对HTFs的杀伤作用;染料传输法观察HTFs细胞间隙连接细胞间通讯(G JIC)的能力;免疫细胞化学检测Cx43分布;RT-PCR及W estern b lot检测Cx43表达。结果旁观者效应随HTFs-tk/HTFs比例增加而增强,高细胞接种密度组明显强于低密度组;染料通过G JIC传输6级以上;Cx43主要分布于HTFs细胞膜并检测到其mRNA与蛋白表达。结论旁观者效应需要细胞间密切接触,Cx43介导G JIC可能是HSV-TK/GCV系统对HTFs产生旁观者效应的主要机制,HTFs表达Cx43可能在结膜伤口愈合反应中发挥重要作用。

细胞缝隙连接与HSV-TK/GCV系统旁观者效应的关系

在用单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统治疗肿瘤的研究中,一个有趣和重要的现象就是旁观者效应(bystander effect,BE)。它在很大程度上提高了HSV-TK/GCV系统治疗肿瘤的疗效。但到目前为止,BE的确切机制尚未阐明。大量研究表明,靶细胞连接蛋白(connexin,Cx)的表达及其形成的细胞间缝隙连接(gapjunction,GJ)与这一现象关系密切。该文对GJ与HSV-TK/GCV系统BE的关系作一综述,并探讨了由HSV-TK/GCV系统生成可经GJ传递的"死亡信号"的性质。

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的 研究以逆转录病毒载体介导的 HSV - tk/ GCV系统对宫颈癌 ME180细胞株的旁观者效应。方法 应用脂质体及 ploybrene转染技术 ,将重组逆转录病毒载体 PL XSN- HSV- tk,导入 PA317包装细胞 ,以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌 ME180细胞 (ME) ,建立 ME/ TK转化细胞株。观察 GCV对 ME、ME/ TK细胞的存活率及旁观者效应。结果 从病毒滴度、电镜及 PCR检查 ,证实 tk基因随病毒的感染已成功地导入 PA 317及 ME180细胞。 ME/ TK细胞对 GCV的敏感性显著高于亲代 ME细胞。 ME/ TK及 ME+ME/ TK混合细胞还随 GCV浓度的增加受到明显的抑制。 ME+ME/ TK混合细胞的存活率 ,随 ME/ TK细胞比例的增加而降低 ,说明 TK/ GCV系统不但能杀伤 tk+ 细胞 ,也能杀伤未导入 tk的细胞 ,存在明显的旁观者效应。结论 HSV- tk/

乳腺癌特异性多肽介导的HSV-TK/GCV系统的构建及其靶向杀伤效应

目的:研究乳腺癌MDA-MB-231细胞特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统对乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外靶向杀伤作用。方法:以PCR从质粒pORF-HSV-TK中扩增目的基因PI-TK,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-PI-TK载体,转化宿主菌,经IPTG诱导表达PI-TK融合蛋白,利用His-Tag对其进行纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白。将不同质量浓度的PI-TK融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,联合更昔洛韦(ganci-clovier,GCV)作用后,倒置显微镜下观察细胞的形态变化,CCK-8法检测MDA-MB-231细胞的增殖。结果:成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-PI-TK,获得纯化的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE及Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白表达正确。单独PI-TK融合蛋白不影响MDA-MB-231细胞的形态和增殖,但PI-TK融合蛋白联合GCV能剂量依赖性靶向抑制MDA-MB-231细胞的增殖,200μg/ml PI-TK+10 mg/LGCV作用的抑制率达(68.9±7.57)%;PI-TK联合GCV抑制MDA-MB-231细胞的IC50值为152.64μg/ml。上述各作用对MDA-MB-435细胞均无影响(P<0.05)。结论:乳腺癌特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统可靶向杀伤MDA-MB-231细胞。

hTERT启动子调控的HSV-tk基因逆转录病毒载体的构建及SKOV3转染细胞的生物学特性观察

目的 :观察转染有人端粒酶逆转录酶基因 (humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)启动子调控的单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (herpessimplexvirusthymidinekinase ,HSV tk)基因的人卵巢癌细胞的部分生物学特性。方法 :构建hTERT启动子调控的HSV tk基因重组逆转录病毒载体 ,筛选携带该载体的包装细胞 ,测定包装细胞产生的逆转录病毒滴度 ,并用病毒颗粒感染人卵巢癌SKOV3细胞 (SKOV3/tk细胞 )并经RT PCR方法鉴定。然后倒置显微镜下观察SKOV3/tk细胞形态 ,MTT法研究细胞生长特性 ,并观察转染细胞裸鼠体内的成瘤能力。结果 :包装细胞产生的病毒滴度可达 2× 1 0 3 cfu·ml-1 。SKOV3/tk细胞扩增出 770bp的tk基因片段 ,形态与SKOV3细胞无明显差异 ;倍增时间 72h ,无明显变化 ;裸鼠体内的成瘤能力较SKOV3细胞下降。结论 :hTERT调控的HSV tk基因逆转录病毒载体构建成功 ;

HSV-tk/GCV系统对ACC-M细胞作用的体外试验

目的：为研究ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统对涎腺腺样囊性癌细胞株（ＡＣＣ－Ｍ）细胞的体外杀伤作用。方法：采用ＭＴＴ法和细胞计数法对ＧＣＶ在不同剂量和不同作用时间时细胞的生存率进行研究。结果：ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统能有效地杀伤ＡＣＣ－Ｍ细胞，杀伤呈时间依赖性和剂量依赖性，这种作用有比较明显的旁杀伤效应，旁杀伤效应的强弱与细胞间的接触程度呈正比关系。结论：ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统能有效地杀伤ＡＣＣ细胞，可望用于ＡＣＣ的治疗。

EB病毒LMP1通过NF-kB介导的HSV-tk/GCV治疗EBV相关肿瘤的研究

目的:研究EB病毒潜伏膜蛋白1(EBV-LMP1)通过活化NF-kB反式激活HIV-LTR进而启动自杀基困HSV-tk在EBV相关肿瘤治疗中的作用,为进一步开展肿瘤治疗提供科学的实验依据。方法:以鼻咽癌细胞为实验模型,将HSV-tk基因置于HIV-LTR调控序列之下,构建LMP1调控且依赖于NF-kB的HSV-tk/GCV系统,采用同位素方法检测tk活性来研究LMP1通过NF-kB调控HSV-tk转录的靶向性和表达特征,MTT方法检测在GCV处理下肿瘤细胞的生长状况。结果:成功构建受LMP1调控且依赖于NF-kB的HSV-tk表达质粒,发现其在GCV处理下,表达LMP1的肿瘤细胞的生长有显著的抑制。结论;携带有LMP1-HSV-tk的细胞对GCV治疗高度敏感,显示这一肿瘤治疗系统在EBV相关肿瘤中具有一定的应用前景。

HSV-tk/GCV系统对NIH3 T3细胞的体外杀伤作用研究

目的 研究HSV tk/GCV系统对NIH3T3细胞系的杀伤作用 ,为与成纤维细胞增殖有关的皮肤病基因治疗提供体外实验依据。方法 应用携带HSV tk基因的重组质粒pPNT tk通过磷酸钙转染传代培养的NIH3T3细胞 ,并经G418筛选 ,获得抗药性细胞集落 ,利用MTT法检测不同浓度GCV对NIH 3T3细胞的杀伤作用。结果 GCV对NIH3T3 /tk细胞有明显的细胞毒性作用 ,当GCV浓度为 10 .0 μmol/L时 ,NIN3T3 /tk细胞的生存抑制率已高达 95 %以上。而在同样药物浓度条件下 ,未转染的对照NIH 3T3细胞的生存抑制率为 11.9% ,与空白对照组相比较 ,差异无显著性。结论 HSV tk/GCV系统对NIH3T3细胞有很好的抑制作用 ,转染后细胞较之未转染细胞对前体药物更昔洛韦的敏感度显著增加 ,且呈剂量依赖性。

HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应

目的 研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 /更昔洛韦 (herpessimplexvirusthymidinekinase /gancyclovir,HSV tk/GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma ,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法 应用脂质体将pCMV/hytk IRES hrGFP质粒导入HXO Rb44细胞株。用潮霉素筛选出阳性细胞克隆并命名为HXO Rb44/tk。RT PCR鉴定hytk基因在HXO Rb44/tk细胞中的转录结果。比较HXO Rb44和HXO Rb44/tk细胞的形态特征及生长特性。通过MTT法检测GCV对不同比例HXO Rb44/tk和HXO Rb44混合细胞的杀伤作用 (“旁观者效应”)。并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制。结果 HXO Rb44/tk细胞经RT PCR可检测出 5 30bp的hytk基因片段。HXO Rb44/tk和HXO Rb44细胞的形态特征及生长特性无明显差异。HXO Rb44/tk细胞仅占很低比例时即可观察到明显的旁观者效应 ,而GCV作用的HXO Rb44/tk细胞上清对HXO Rb44细胞无杀伤作用。结论 HSV tk基因转移联合GCV治疗可作为Rb基因治疗的一种有效方法 。

HSV-tk/GCV自杀基因系统对喉癌细胞杀伤作用的体外研究

目的 研究逆转录病毒介导的HSV tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。方法 构建携带HSV tk基因的逆转录病毒载体 ,并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep 2。以G4 18筛选的抗性克隆 (命名为Hep 2 /tk) ,用MTT比色法观察GCV在体外对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。结果 Hep 2 /tk细胞与未转染tk基因的Hep 2 /0、Hep 2细胞相比较 ,三者的生长速度无明显差别。Hep 2 /tk细胞对GCV高度敏感 ,即低浓度GCV(0～ 1mg/L)处理Hep 2 /tk细胞 7d,可将其大部分细胞杀死 ,增加GCV的浓度 (>1mg/L)不能显著增强其对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。 结论 人喉癌细胞Hep 2对HSV tk/GCV系统高度敏感 。

腺病毒介导的HSV-tk/GCV系统对肺癌细胞的杀伤作用

目的:用含HSV-tk重组腺病毒载体转染Lewis肺癌细胞,探讨其对肺癌细胞的杀伤作用。方法:利用同源重组技术构建含HSV-tk基因的重组腺病毒载体(AdCMVtk),将含LacZ基因的腺病毒载体(AdCMVLacZ)转染Lewis肺癌细胞,X-gal染色后,测定腺病毒对该细胞的转染率,并观察AdCMVtk/GCV系统对Lewis肺癌细胞存活率的影响。结果:随着AdCMVLacZ的病毒量(MOI)增加,对Lewis细胞转染率也增加,当MOI为500时,转染率可达100%。AdCMVtk/GCV系统可明显杀伤Lewis细胞,且随着AdCMVtk的MOI增加,或GCV浓度的增加,细胞存活率减少,但单独使用AdCMVtk或GCV时,对Lewis细胞无杀伤作用。AdCMVtk/GCV系统对该细胞的杀伤作用具有明显的旁观者效应,20%Lewis细胞被AdCMVtk转染可引起74%细胞死亡。结论:AdCMVtk/GCV系统杀伤肿瘤细胞既有效又安全。

VP22的细胞间传递作用对HSV-tk/GCV的肿瘤细胞杀伤促进效应

目的 :探讨VP2 2的细胞间传递作用对HSV tk/GCV杀伤肿瘤细胞的促进作用。方法 :将VP2 2与报告基因 绿色荧光蛋白基因 (GFP)或前药酶基因 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV tk)构建在同一载体上 ,进行DNA序列分析鉴定 ;将此融合基因载体转染 2 93T或COS7细胞 ,免疫荧光分析确定转染情况和细胞间传递作用 ;在前药GCV不同浓度、转染与未转染细胞比例不同时 ,MTT法检测细胞增殖情况 ;利用转染细胞培养液上清培养未转染细胞 ,确定旁观者效应是否由培养液转移。结果 :PCR及序列分析显示融合基因插入载体正确 ;对 2 93T或COS7细胞转染率可达 2 5 %～ 3 0 % ,且证明融合蛋白已被表达并在细胞间传递 ;HSV tk与VP2 2融合后在前药GCV浓度低至 0 .1μg/ml时就可显示出细胞杀伤效应增强 ,并随着表达VP2 2 HSV tk细胞比例的增加 ,细胞杀伤作用增强。结论 :VP2 2介导的自杀基因产物的细胞间传递作用可解决自杀基因的低效细胞毒作用 ,明显增强细胞杀伤效应。

腺病毒介导的HSV-tk体外抗喉癌作用

目的观察 HSV- tk/ GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法将带有报告基因 L ac Z的 5型缺陷性腺病毒载体Ad CMVL ac Z感染喉癌细胞 Hep- 2 ,X- gal染色 ,测定腺病毒的转染率。利用同源重组技术构建含 HSV- tk基因的重组腺病毒载体 Ad CMVtk。Ad CMVtk感染 Hep- 2细胞后 ,加入 10 mg/ L GCV,观察瘤细胞存活率及旁观者效应。结果随着腺病毒感染复数量 (multiplicity of infection,MOI)增加 ,对 Hep- 2细胞转染率亦增加 ,10 0 %转染所需的 MOI为 2 0 0。 Ad CMVtk/ GCV对Hep- 2细胞的杀伤强度与 Ad CMVtk量呈正向关系 ,即有浓度依赖性。此杀伤作用存在旁观者效应 ,但较弱。结论腺病毒介导的 HSV- tk/ GCV具有杀伤喉癌细胞作用。

Hsv-tk、重组人IL-2、TNF-α融合基因表达载体的构建与鉴定

目的:构建含有Hsvtk、重组人IL2rhIL2、TNFαrhTNFα不同组合融合基因的逆转录病毒表达载体。方法:经分离人外周血单个核细胞peripheralbloodmononuclearcellPBMC总RNA,以反转录聚合酶链反应reversetranscriptionpolymerasechainreactionRTPCR制备人IL2互补DNAcomplementaryDNAcDNA模板。分别以PCR方法扩增3种基因,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆经鉴定后测序。将测序正确的各目的基因分别从测序载体相应酶切位点消化后,回收并纯化后与经相同双酶消化后的线性化PLXSN表达载体连接,连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经筛选后随机挑取阳性菌落后,提取质粒酶切鉴定插入片段大小和位置以获得正确重组子。按上述定向克隆方法依次将各片段正向插入至PLXSN表达载体的多克隆位点间,以构建含不同融合基因的真核表达载体。结果:经限制性酶切分析及PCR方法鉴定,各插入基因及融合基因大小、位置、方向均正确无误。结论:Hsvtk、IL2、TNFα不同组合融合基因表达载体的成功构建为喉癌的基因治疗提供部分实验基础也为表达具有多功能活性的新型融合蛋白和发现细胞因子的新功能提供有利条件。

Hsv-tk、重组人TNF-α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的 :构建 pEGFP -TK -rhTNF -α表达载体 ,观察其在喉癌细胞Hep - 2中的瞬时表达。方法 :应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体 pGEM -T -Easy测序 ,利用逆转录病毒载体PLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK -rhTNF -α并将其亚克隆至pEGFP -N3的EcoRI和BamHI位点间 ,成功构建表达载体 pEGFP -TK -rhTNF -α ,并在该载体转染人喉癌细胞Hep - 2后观察融合蛋白表达情况。结果 :酶切鉴定证实TK -rhTNF -α融合基因片段已克隆到pEGFP -N3的EcoRI和BamHI位点间 ,并在转染人喉癌细胞Hep - 2中观察到TK -rhTNF -α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论 :pEGFP -TK -rhTNF -α表达载体便于观察转染细胞中TK -rhTNF -α融合蛋白的表达情况及蛋白定位 。

利用HSV-TK基因治疗肝癌的离体研究

利用ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ－ＴＫ基因克隆至逆转录病毒载体（ＸＭ－６／ＴＫ）。经ＰＡ３１７细胞包装后，转染人肝癌细胞ＨｅｐＧ２。结果显示，ＸＭ－６／ＴＫ转染ＨｅｐＧ２细胞与野生型相比，其生长特点和细胞形态未有改变。给予抗病毒药物－环氧鸟苷（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ＧＣＶ）后，转染细胞生长受到严重抑制，细胞数量明显降低。细胞学检查证实，ＧＣＶ处理后，转染细胞的死亡率显著增加。本结果提示。