HSV-tk/ACV系统基因治疗小鼠黑色素瘤的实验研究

本文首次应用HSV-tk/ACV系统对小鼠黑色素瘤B16进行了基因治疗研究。体外实验证实,转有HSV-tk基因的B16细胞(B16LNTK)对阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)的敏感性显著高于其亲本细胞B16,当B16LNTK与B16以不同比例混合培养时,亲本细胞B16对ACV的敏感性不同程度增高,存在旁观者效应。用B16LNTK接种同系C57BL/6小鼠,经ACV治疗20天后,B16LNTK组小鼠的肿瘤(0.254±0.18cm^3)较对照组B16组的肿瘤(4.43±1.08cm^3)小94％(n=5,双侧t检验P<0.01)。HSV-tk/ACV系统原位基因转移治疗B16荷瘤小鼠效果显著:HSV-tk/ACV治疗组肿瘤14天后较对照组肿瘤小43％(n=5,双侧t检验P<0.05)。结果提示HSV-tk/ACV系统可作为黑色素瘤基因治疗研究的一种有效方法。

阳离子脂质体介导HSV-TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞增殖活性的影响

目的 探讨HSV TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞增殖活性的影响。方法 用阳离子脂质体Lipofectamine将 pCR3 Uni及含HSV TK基因的真核表达载体 pCR3 TK转染至人脑胶质瘤细胞株TJ90 5中 ,筛选出阳性克隆 ,阳性细胞克隆给予ACV(5 0mg/ml) ,72小时后 ,收集玻片 ,进行AgNOR染色。 结果 转染HSV TK基因的细胞 ,在给予ACV后 ,细胞增殖活性明显降低 ,转染 pCR3 Uni和 pCR3 \|TK细胞克隆的AgNOR颗粒数分别为 1 4.3 3和 6.67(P <0 .0 1 )。结论 AgNOR计数是一种操作简便、检测细胞增殖活性的方法 ,为研究HSV

自杀基因HSV-TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞DNA含量的影响

目的 探讨HSV-TK/ACV系统的抗肿瘤机制。方法 将新近克隆并构建的含HSV-TK基因的真核表达载体pCR3-TK,用Lipofectamine转染至人脑胶质瘤TJ905细胞中,给予ACV,用FCM检测了对细胞DNA含量的影响。结果 转染了TK基因的细胞在ACV的作用下,DNA含量下降(分别为109.43和65.81;而对照组分别为109.28和83.24,细胞DNA的合成被抑制。结论 证实了我们克隆的TK基因对人脑胶质瘤的杀伤作用,同时也将HSV-TK/ACV系统的抗肿瘤机制研究推进了一步。

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究──Ⅱ.HSV-tk/ACV系统的安全性研究

采用细胞接种、X－gal染色、TK基因的PCR和病理切片观察，分别将PA317／BAG．PA317／TK产病毒细胞注射到动物体内，结果产病毒细胞在动物体内存活期均不超过1个月；产病毒细胞在体内没有形成肿瘤，也没有发现严重的炎症反应；HSV－tk／ACV系统用于动物基因治疗，ACV及其代谢产物没有发现明显的毒副作用和病理改变。说明反转录病毒介导的HSV－tk／ACV系统在动物体内取得了安全的结果。

阳离子脂质体介导HSV-TK/ACV基因系统抑制人肺癌生长的实验研究

目的:探讨阳离子脂质体介导的HSV-TK/ACV基因系统治疗人肺癌的实验研究的意义。方法:利用已构建的真核表达质粒pCR3-TK,用阳离子脂质体LipofectAMINE为载体,将pCR3-TK转染Anip973细胞株,然后给予不同浓度的Aciclovir(ACV)。结果:经MTT检测证实转染了TK基因的肺癌细胞对ACV的杀伤敏感性明显提高,FCM检测可以看到凋亡峰的出现,且相应的S期细胞比率增高。结论:HSV-TK/ACV系统对人类肺癌细胞株Anip973具有良好的抑制作用;阳离子脂质体LipofectAMINE对人类肺癌细胞株Anip973安全、低毒,有可能成为基因治疗应用到临床试验的有价值的载体。

反转录病毒介导的 HSV-tk/ACV 系统基因治疗的安全性研究

研究了反转录病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统基因治疗脑肿瘤的安全性。首先采用ＰＣＲ、反转录ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交以及补救分析方法，对ＨＳＶ－ｔｋ病毒包装细胞（ＴＫ／ＶＰＣ）、Ｃ６转ＴＫ基因细胞和实验动物血液进行了检测。结果表明，所采用的反转录病毒基因转移系统没有产生野生型病毒，是安全的；另一方面，采用细胞接种、Ｘ－ｇａｌ染色、ｔｋ基因的ＰＣＲ和病理切片观察方法，对ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统本身的安全性进行了探讨，结果表明ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统用于动物基因治疗，ＡＣＶ及其代谢产物没有发现明显的毒副作用和病理改变。反转录病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统是安全的。

HSV-TK/ACV治疗小鼠肺腺癌LA795及其与机体免疫系统的关系

目的 :探讨HSV -TK/ACV(GCV)系统对小鼠肺腺癌细胞LA795治疗作用及其与机体免疫系统的关系。方法 :用重组逆转录病毒载体上清感染体外培养的小鼠肺腺癌细胞LA795 ,然后用新霉素类似物G41 8进行筛选 ,得到转染HSV -TK基因的LAtk细胞 ,分别将LA795细胞和LAtk细胞接种于小鼠皮下 ,观察ACV治疗后肿瘤生长情况、抗免疫功能以及对动物生存期的影响。结果 :体外转染HSV -TK基因的LAtk细胞获得了对ACV的敏感性 ,接种LAtk细胞的治疗组动物在ACV治疗后出现了肿瘤体积缩小 ,而对照组接种LA795细胞的动物在ACV治疗后肿瘤体积逐渐增大 ,两者具有显著差异 (P<0 .0 1 )。治疗组动物生存期为 5 1 .8d ,对照组动物生存期平均为 1 5 .9d ,两者具有显著差异 (P <0 .0 1 )。光镜下观察治疗组肿瘤组织及血管周围有大量的淋巴细胞浸润 ,计数 75个高倍视野中的淋巴细胞为 1 1 6.0 3± 5 2 .95 ,而对照组为 1 0 .41± 5 .5 2 ,二者具有显著差异 (P <0 .0 1 )。超微结构观察显示淋巴细胞群攻击癌细胞现象 ,癌细胞出现凋亡征象。结论 :①HSV -TK/ACV系统可以显著杀伤小鼠肺腺癌细胞LA795 ,使肿瘤消退 ,动物生存期延长 ,提示该系统有良好的治疗效果和应用前景。②HSV -TK/ACV系统治疗肿瘤除了其直接杀伤作用外 ,尚有机体免疫系统的?

肝癌HSV-tk/ACV基因治疗的实验研究

目的 :观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV - tk基因 ,自杀基因 )与阿昔洛韦 (ACV)系统对人肝癌细胞的体外杀伤效果。方法 :体外培养已感染含 HSV- tk基因的重组逆转录病毒的 PA317- tk细胞 ,获取含 HSV- tk基因的重组逆转录病毒颗粒。用后者感染人肝癌细胞株 SMMC- 772 1,G418培养基筛选抗性克降 SMMC- 772 1- tk,并以 PCR技术检测 HSV- tk基因判断转染成功与否。用形态学方法和 MTT法检测 ACV对 SMMC- 772 1- tk细胞的杀伤作用。结果 :SMMC- 772 1- tk细胞经 PCR证实含 PCR- tk基因。形态学观察显示 ,ACV浓度在 0 .0 1～ lμg/ ml时 ,SMMC- 772 1- tk细胞小部分死亡 ,在浓度自 1μg～ 10 0 0μg/ m l时 ,细胞大部分死亡 ;HE染色可见细胞凋亡。MTT法测定显示 ,ACV浓度自 1μg/ ml开始即对 SMMC- 772 1- tk细胞产生明显抑制作用 ,抑制率自 49%到 78% ,作用强度呈 ACV浓度依赖性。各种浓度的 ACV对 SMMC- 772 1细胞没有或只有轻度抑制作用。结论 :HSV- tk/ACV系统体外对肝癌细胞有明显的杀伤作用 ,有可能成为临床基因治疗方案。

p53基因增强恶性胶质瘤HSV-TK/ACV系统疗效的体外研究

目的 :体外研究p5 3基因提高恶性胶质瘤HSV TK/ACV系统自杀基因治疗疗效的可行性。方法 :以腺病毒为载体转导p5 3和HSV TK基因入C6鼠胶质瘤细胞 ,给以不同浓度的ACV ,MTT法监测细胞生存率 ,TUNEL法检测凋亡。评价p5 3基因提高HSV TK/ACV系统治疗胶质瘤的疗效。结果 :p5 3明显提高鼠胶质瘤细胞对HSV TK/ACV的敏感性 ,p5 3联合HSV TK转染C6的ACVID50 (1μg·mL-1)和ID10 0 (10 μg·mL-1)较单独HSV TK转染C6的ACVID50 和ID10 0 提高 10倍 ,并可使C6细胞凋亡增加。结论 :p5 3基因可明显增强胶质瘤HSV

HSV-TK/ACV系统促肾癌细胞株GRC-1细胞凋亡的实验研究

目的 观察HSV TK/ACV系统对肾癌GRC 1细胞的杀伤作用及旁观者效应。方法 将含不同浓度的肾癌GRC 1/TK细胞与肾癌GRC 1细胞混合培养 ,分为 4组 ,分别含GRC 1/TK细胞 0 %、2 5 %、5 0 %及 10 0 % ,分别用无环鸟苷 6 0 μg/ml进行处理 ,观察细胞形态改变、测定活细胞数并行流式细胞术、电子显微镜检查。结果 实验组与对照组GRC 1细胞均无明显变化 ;含 2 5 %以上GRC 1/TK细胞可观察到明显的杀伤作用 ,并有凋亡峰及凋亡小体形成。结论 HSV TK/ACV系统对肾癌GRC 1细胞具有明显的杀伤作用及旁观者效应 。

HSV-tk基因和IL-12基因抑制VEGF的表达及对鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放射增敏作用的实验研究

目的:研究HSV-tk基因和IL-12基因抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达对鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放射增敏作用。方法:建立鼻咽癌荷瘤裸鼠模型,将42只成瘤鼠随机分成IL-12组、IL-12+放射治疗组、HSV-tk/GCV组、HSV-tk/GCV+放射治疗组、IL-12+HSV-tk/GCV组、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组、空白对照组、每组6只。采用瘤内注射分别给予相对应的重组腺病毒液(AdKDR-tk)、重组逆转录腺病毒液IL-12及生理盐水,24 h后重复注射1次。次日起HSV-tk/GCV组、HSV-tk/GCV+放射治疗组、IL-12+HSV-tk/GCV组、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组连续10 d每天腹腔内注射GCV 100 mg/(kg·d),连续10 d。各放射治疗组第3周开始给予6MV-X照射,每天2 Gy,连续5 d。治疗结束后处死裸鼠,检测裸鼠肿瘤质量及肿瘤生长抑制率,免疫组织化学法检测肿瘤微血管密度及VEGF阳性细胞灰度值。结果:IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组裸鼠瘤体质量明显低于IL-12组、IL-12+放射治疗组、HSV-tk/GCV组、HSV-tk/GCV+放射治疗组,差异均有统计学意义(P<0.05)。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组的肿瘤生长抑制率最高,达71.7%。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组微血管密度均低于其他各组,VEGF阳性细胞灰度值均高于其他各组(P<0.05)。结论:HSV-tk基因和IL-12基因联合应用在鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放疗中可抑制移植瘤的生长,为鼻咽癌的放疗产生增敏作用。

阳离子脂质体介导HSV-TK基因对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用

目的 观察阳离子脂质体介导的HSV TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法 将新近克隆的含HSV TK基因的真核表达载体pCR3 TK ,用阳离子脂质体Lipofectamine转染至人脑胶质瘤细胞株TJ90 5中 ,筛选出阳性克隆 ,给予不同浓度的ACV ,观察不同时间对细胞的杀伤情况 ,并用MTT方法检测不同细胞对ACV的反应情况。结果 转染TK基因的胶质瘤细胞对ACV的杀伤敏感性明显提高 (P <0 .0 1 ) ,ACV对转染TK基因的胶质瘤细胞有特异性抑制和杀伤作用。结论 阳离子脂质体Lipofectamine是一种简便、安全、有效的基因转移方法。可用阳离子脂质体介导pCR3 TK转移 ,进行胶质瘤HSV TK/GCV基因治疗的研究 。

气垫船导管内蒙皮结构疲劳分析

针对气垫船导管内蒙皮结构使用中出现撕裂的问题,应用实测载荷和材料数据,进行有限元静强度分析,基于采用名义应力法,采用MSC Fatigue进行疲劳分析,根据结果对内蒙皮结构做改进设计,表明导管内蒙皮结构须按疲劳强度要求进行设计,提出的名义应力法可用于导管内蒙皮结构疲劳强度评估。

面向智能驾驶的轻量化GwcNet立体匹配算法研究

智能驾驶技术作为新一代智能交通系统的核心之一,受到了广泛关注。其中,感知融合技术在实现智能驾驶的精准定位和环境感知中起着至关重要的作用。在感知融合中使用的立体匹配算法更是关乎智能驾驶的安全性和准确性,是智能驾驶环境感知领域中重要的技术环节。针对智能驾驶汽车在硬件方面算力不足,但对立体匹配算法实时性和精度均有较高要求的问题,文章基于GwcNet,为智能驾驶环境感知模块设计了一种轻量化的立体匹配算法。利用ACV模型替代GwcNet立体匹配算法中参数量、运算量最大的3D卷积模块,使得算法的实时性和精度得到提升。为了进一步减少网络复杂度,减小ACV模块中的网络参数,提出一个Fast-ACV模型。最后在KITTI 2015数据集中对立体匹配算法进行对比分析。结果表明,所提出的轻量化GwcNet立体匹配算法在精度和实时性上均优于GwcNet算法。

B7联合HSV-TK基因对大鼠乳腺癌的治疗作用

目的 :探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV- TK)和共同刺激因子 B7基因联合使用对乳腺癌动物模型的体内治疗作用。方法 :应用基因重组技术 ,构建分别携带 HSV- TK,B7及 HSV- TK/B7双基因的逆转录病毒载体。以 SHZ- 88细胞株建立乳腺癌动物模型 ,随机分为对照组、TK组、B7组及 TK/B7组 ,每组 2 0只。 2周后于瘤体内分别注射转染有空载体及不同的重组载体的乳腺癌细胞 ,3d后于腹腔内连续注射无环鸟苷 (GCV) 15 d(5 0 mg· kg- 1· d- 1 ) ,观察肿瘤体积、荷瘤生存时间的变化和组织病理改变。结果 :B7组、TK/B7组肿瘤内淋巴细胞浸润明显增多。与对照组相比 ,TK组、B7组肿瘤生长减缓 ,体积减小 ,荷瘤生存期延长 ,两组间均有显著差异 (P<0 .0 5 ) ,而 TK /B7组尤为显著 (P<0 .0 1) ;TK组与 B7组相比则无显著差异。 结论 :HSV- TK,B7基因联合治疗乳腺癌动物模型 ,能直接杀伤肿瘤 ,抑制肿瘤生长 ,延长荷瘤动物的生存期。

阳离子脂质体介导HSV-TK基因治疗人脑胶质瘤的实验研究

颅内恶性肿瘤以胶质瘤最为多见,胶质瘤的预后较差,一直困扰着神经外科医师。本文旨在观察阳离子脂质体介导的HSV-TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法:本文将新近克隆并构建的含HSV-TK基因真核表达载体用阳离子脂质体介导转染至人脑胶质瘤细胞中,筛选出阳性克隆,通过MTT、FCM及AgNOR检测转染了HSV-TK基因的FJ905胶质瘤细胞对不同浓度的ACV的反应情况。结果:转染了TK基因的胶质瘤细胞在给予ACV后,细胞发生明显的肿胀、变性,以致形成碎片,而未转染TK基因的胶质瘤细胞变化不明显。转染TK基因和未转染TK的肿瘤细胞经ACV作用后,DNA的含量分别为65.81和109.43,两者之间差异显著(P<0.05)。AgNOR嗜银染色测定结果,转染了TK基因和未转染TK基因的肿瘤细胞经ACV作用后,两者测定结果分别为6.67±1.03和14.83±1.47,两者之间差异极显著(P<0.01)。结论:转染了TK基因的胶质瘤细胞对ACV的敏感性明显提高,ACV能明显抑制转染TK基因细胞的DNA合成;HSV-TK/ACV治疗后,人脑胶质瘤细胞的增殖活性降低了。提示HSV-TK/ACV系统可为胶质瘤的基因治疗提供一种可探索的方法。

HSV-tk/GCV系统杀伤ACC-M细胞的机理研究

目的 为探索HSV-tk/GCV(单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因/羟甲基无环鸟苷)基因治疗系统杀伤人高转移性腺样囊性癌细胞ACC-M 的机理。方法 采用荧光染色荧光显微镜观察、细胞DNA 电泳、流式细胞仪检测等方法。结果 研究发现,荧光染色有明显的细胞凋亡小体和染色质边聚现象;在GCV浓度较大(400 μm ol/L)作用时间较长(4 天)时有较明显的DNA 梯状现象;而FCM 发现在400 μm ol/LGCV 作用下有极明显的亚G1 峰。结论 HSV-tk/GCV基因治疗系统杀伤ACC-M

丹参酮ⅡA对HSV-TK/GCV系统治疗肺癌细胞株的影响

目的 观察并探讨丹参酮 A(Tan A)对逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV- TK/GCV)系统对治疗人小细胞肺癌细胞株的影响。方法 用逆转录病毒感染 H4 4 6细胞 ,筛选出含 TK基因的 H4 4 6细胞 (H4 4 6 /TK)。用丙氧鸟苷 (GCV)及 Tan A处理不同比例混合的 H4 4 6、H4 4 6 /TK细胞 ,用 MTT比色法检测细胞存活率。结果 重组逆转录病毒滴度为 3.2× 10 5cfu/ml,电镜观察证实 HSV- TK基因已导入H4 4 6细胞。H4 4 6 /TK细胞对 GCV的敏感性明显高于 H4 4 6细胞 ,并存在旁观者效应 ;Tan A与 GCV共同作用下的肿瘤细胞对 GCV的敏感性大大增强 ,在不同比例混合的 H4 4 6、H4 4 6 /TK细胞中 ,加入 Tan A组和不加丹参酮组相比较 ,其存活率有显著性差异 (P<0 .0 5 )。结论 Tan A能显著增强 HSV- TK/GCV系统的旁观者效应。

HSV-tk/GCV协同放射治疗黑色素瘤的实验研究

目的：了解ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统协同放射治疗对小鼠黑色素瘤的联合杀伤作用。方法：通过逆转录病毒介导，将潮霉素磷酸转移酶和ＨＳＶ－ｔｋ的融合基因（ｈｙｔｋ）导入黑色素瘤细胞中并获得表达，通过体外和Ｃ５７ＢＬ／６小鼠动物实验，检测 ＧＣＶ对转基因细胞的体内外杀伤作用及联合应用放射治疗对黑色素瘤的治疗作用。结果：ＰＣＲ、ＲＮＡ Ｄｏｔ ｂｌｏｔｔｉｎｇ、免疫组化检测证实ＨｙＴＫ在转基因细胞的表达，体内外实验示ＧＣＶ对Ｂ１６／ＨｙＴＫ细胞有明显的杀伤作用，而对野生型Ｂ１６细胞无明显杀伤作用（Ｐ＜０．０５）；联合应用低剂量ＧＣＶ可使转入ｈｙｔｋ基因的黑色素瘤细胞对放疗的敏感性明显增高（ＳＥＲ＝１．６２），体内实验也证实协同疗法可延缓荷瘤小鼠的肿瘤生长。结论：ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统协同放射治疗有望成为黑色素瘤基因治疗的一种有效方法。

利用HSV-TK基因治疗肝癌的离体研究

利用ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ－ＴＫ基因克隆至逆转录病毒载体（ＸＭ－６／ＴＫ）。经ＰＡ３１７细胞包装后，转染人肝癌细胞ＨｅｐＧ２。结果显示，ＸＭ－６／ＴＫ转染ＨｅｐＧ２细胞与野生型相比，其生长特点和细胞形态未有改变。给予抗病毒药物－环氧鸟苷（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ＧＣＶ）后，转染细胞生长受到严重抑制，细胞数量明显降低。细胞学检查证实，ＧＣＶ处理后，转染细胞的死亡率显著增加。本结果提示。