Rho A蛋白通路在DLC-1基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制

目的:探讨Rho A蛋白通路在DLC-1(frequently deleted in liver cancer-1)基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制。方法:构建pcDNA3.1-DLC1质粒载体,脂质体法转染HT29细胞,筛选稳定细胞系;pull-down方法分析Rho A蛋白活性;实时定量PCR检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1、p21的表达变化;流式细胞仪检测细胞周期分布。结果:野生型人结肠癌HT29细胞DLC-1基因表达呈阴性,经转染获得DLC-1稳定表达细胞系。与野生型及空载组HT29细胞相比,转染组细胞RhoA蛋白活性下降;Cyclin D1表达下调,p21表达上调;G1期及凋亡细胞数增加,而G2期细胞数下降。结论:转染DLC-1基因引起人结肠癌HT29细胞Rho A蛋白活性下调,进而可能通过对Cyclin D1、p21表达的调控使细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡,同时分裂前期细胞数减少,细胞增殖受抑。

RhoGAP结构域在DLC-1基因抑制人结肠癌HT29细胞增殖、侵袭中的作用

目的:探讨Rho蛋白GTP酶活化蛋白(Rho GTPase activation protein,RhoGAP)结构域在肝癌缺失基因1(frequentlydeleted in liver,DLC-1)抑制人结肠癌HT29细胞的增殖、侵袭中的作用。方法:脂质体转染DLC-1基因及RhoGAP结构域缺失的ΔDLC-1亚克隆至大肠癌HT29细胞株;应用MTT、平板克隆实验检测细胞增殖的改变;Transwell实验观察细胞侵袭迁移能力的改变;流式细胞术检测细胞周期。结果:转染成功后,全长DLC-1基因转染组(pcDNA3.1-DLC1-HT29)与野生型及空载组相比,细胞增殖能力下降,侵袭能力减弱,细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡,而ΔDLC-1亚克隆转染组(pcDNA3.1-ΔDLC1-HT29)对细胞增殖、侵袭及细胞周期均无明显影响。结论:DLC-1基因可能是通过其内在的RhoGAP结构域抑制人结肠癌细胞HT29的增殖和侵袭。

苦参碱对HT29人结肠癌细胞凋亡及Bax和BcL-2蛋白表达的影响

目的 研究苦参碱对人结肠癌HT29细胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响.方法 取HT29人结肠癌细胞体外培养,加苦参碱处理24～48 h.采用MTT法检测细胞增殖,使用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,采用Western Blot法检测Bax和Bcl-2蛋白表达.结果 在2～16 mg/mL苦参碱作用下,HT29细胞增殖被明显抑制,且呈剂量和时间依赖性（P＜ 0.05或P＜0.01）;给予4、8和16 mg/mL苦参碱作用HT29细胞24 h后,细胞凋亡率分别为（14.84±2.35）％、（37.80±2.49）％和（54.10±1.60）％,均明显高于对照组（4.36±0.23）％（P＜0.05）;经苦参碱作用24 h后,细胞Bax蛋白表达增加,而BcL-2表达减少,呈剂量依赖性.结论 苦参碱能抑制HT29细胞增殖,并促进其凋亡,其机制可能与抑制BcL-2和促进Bax蛋白表达有关.

信号转导子与转录活化子6(STAT6)在人结肠癌细胞株HT29(STAT6^(high))、Caco2(STAT6^(null))细胞凋亡中的作用

目的通过分析信号转导子与转录活化子6(signal transducer and activator of transcription 6,STAT6)活化状态时不同的人结肠癌细胞株HT29(STAT6high)和Caco2(STAT6null)凋亡情况来研究STAT6与细胞凋亡之间的关系,并从分子水平探讨其可能的机制。方法采用流式细胞仪检测人结肠癌细胞株HT29(STAT6high)和Caco2(STAT6null)细胞凋亡的情况,比较其差异;同时采用RT-PCR检测人结肠癌细胞株HT29(STAT6high)和Caco2(STAT6null)中凋亡相关基因(Caspase家族蛋白Caspase3 mRNA、Caspase7 mRNA和Bcl-2家族蛋白凋亡抑制蛋白Bcl-2 mRNA、Bcl-xl mRNA、促凋亡蛋白Hrk mRNA)的表达水平,比较其差异。结果人结肠癌细胞株Caco2(STAT6null)细胞早期凋亡率为(13.30±0.73)%,明显高于HT29(STAT6high)的(2.00±0.43)%(P<0.01)。RT-PCR显示,人结肠癌细胞株Caco2(STAT6null)中Caspase3 mRNA和Caspase7 mRNA表达水平均明显高于HT29(STAT6high)(均P<0.01)。人结肠癌细胞株Caco2(STAT6null)中凋亡抑制蛋白Bcl-2 mRNA、Bcl-xl mR-NA、促凋亡蛋白Hrk mRNA表达水平均明显高于HT29(STAT6high)(均P<0.01)。人结肠癌细胞株Caco2(STAT6null)、HT29(STAT6high)中STAT6活性水平与Caspase7、Caspase3、Bcl-2、Bcl-xl、Hrk mRNA表达水平均呈负相关(r=-0.514、-0.562、-0.518、-0.512、-0.426,均P<0.05)。结论 STAT6可能参与结肠癌细胞凋亡,其机制可能与凋亡相关基因的表达有关。

血管活性肠肽对体外大肠癌 HT29细胞粘附和侵袭作用的影响

目的观察血管活性肠肽(VIP)和双丁酰环磷酸腺苷(db-cAMP)对体外大肠癌 HT29细胞对大鼠血管内皮的粘附和侵袭的影响。方法取出大鼠主动脉,建立体外癌细胞—血管内皮粘附试验模型。用光镜和扫描电镜观察 HT29细胞对大鼠血管内皮粘附作用和其形态学变化,以及 VIP 和 db-cAMP 对细胞粘附的影响并在扫描电镜上计数量化分析。结果在血管内皮上可清晰辨认癌细胞并可观察其对血管内皮的粘附和侵袭的形态学改变.VIP 组的粘附细胞和高活性粘附细胞显著多于对照组(P<0.05),相反 db-cAMP 则无此作用.结论 VIP可促进体外 HT29细胞对血管内皮的粘附和侵袭,其机制可能与激活癌细胞 A 激酶系统有关。

己糖激酶Ⅱ在结肠癌HT29细胞增殖侵袭中的作用

目的:探讨己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ,HKⅡ)在结肠癌HT29细胞生长增殖中的作用。方法:构建HKⅡshRNA质粒,转染结肠癌细胞系HT29细胞,实时定量PCR检测HKⅡ的表达,用划痕法和Transwell法检测细胞增殖侵袭能力的变化。结果:shRNA质粒转染HT29细胞后,HKⅡ表达明显减弱,细胞的增殖侵袭能力明显减弱(P<0.05)。结论:HKⅡ可能在结肠癌细胞的增殖侵袭中起重要作用。

白头翁皂苷体外抗肿瘤试验研究

为研究白头翁皂苷体外抗肿瘤活性,从白头翁中提取有效成分皂苷,对大肠癌HT29细胞和人胃癌细胞株BGC823进行体外培养,用MTT法测定白头翁皂苷对2种肿瘤细胞增殖反应的影响。结果表明:白头翁皂苷对两种肿瘤细胞增殖有较强的抑制作用,并表现一定的剂量关系,白头翁皂苷浓度为6μg.mL-1时,对人胃癌细胞株BGC823细胞生长的抑制率达到了80.71%,效果较好。因此,白头翁皂苷作为抗肿瘤药物有效成分的开发和利用有待于进一步深入研究。

脂质体槲皮素对小鼠结肠腺异位实体瘤的影响研究

目的考察脂质体槲皮素对人结肠癌腺细胞株HT29 BALB/c小鼠异位实体瘤的作用。方法建立HT29结肠腺癌BALB/c小鼠肿瘤模型,将48只成模小鼠随机分成模型组、脂质体槲皮素组、槲皮素组、5-氟尿嘧啶组,每组12只。接种后4 d,模型组小鼠腹腔注射生理盐水0.3 mL,脂质体槲皮素组腹腔注射脂质体槲皮素50 mg/kg,槲皮素组腹腔注射槲皮素50 mg/kg,5-氟尿嘧啶组腹腔注射5-氟尿嘧啶15 mg/kg,每隔3 d注射1次,共注射8次。干预过程中记录各组小鼠肿瘤体积和体质量;末次注射后3 d处死各组小鼠,剥离肿瘤,称质量,测肿瘤体积,计算瘤体积抑制率和瘤质量抑制率,HE染色观察肿瘤病理表现。结果各组小鼠均无死亡,脂质体槲皮素组、槲皮素组的肿瘤体积均明显小于模型组(P均<0.05),但各组小鼠体质量比较差异无统计学意义(P均>0.05);脂质体槲皮素组、槲皮素组、5-氟尿嘧啶组的瘤体积抑制率分别为25.43%,22.27%,26.06%,瘤质量抑制率分别为15.47%,13.37%,16.66%,脂质体槲皮素组和5-氟尿嘧啶组均明显高于槲皮素组(P均<0.05),脂质体槲皮素组与5-氟尿嘧啶组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。HE染色显示脂质体槲皮素组与5-氟尿嘧啶组肿瘤坏死区域较模型组小,2组病理表现相似。结论脂质体槲皮素对HT29实体瘤有较好的抑瘤作用。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因对人大肠癌细胞株HT29作用的研究

目的 探讨肿瘤坏死因子 (TNF)相关的凋亡诱导配体基因 (TRAIL)用于人大肠癌细胞株HT2 9基因治疗的实验研究。方法 将重组腺病毒载体 (Ad)介导的TRAIL基因作用于人大肠癌细胞株HT2 9,通过相差显微镜、MTT比色法和流式细胞仪 ,研究分析其对HT2 9细胞作用的效果。结果Ad/GT TRAIL能引起HT2 9细胞出现明显的形态学改变 ,对HT2 9细胞的生长抑制率和凋亡诱导率分别为 5 4 .3%和 11.1% ;联合Ad/PGK GV16后 ,生长抑制率和凋亡诱导率均显著提高 (P <0 .0 5 ) ,分别为 82 .7%和 2 4 .6 %。结论 Ad/GT TRAIL能有效诱导HT2 9的凋亡从而抑制HT2 9的生长 ,联合Ad/PGK GV16后将显著提高其疗效。

5-Aza-CdR对HT29细胞DLC-1基因表达及生物学行为的影响

目的研究去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-Aza-CdR)对人结肠癌HT29细胞株生物学行为及肝癌缺失基因1(DLC-1)表达的影响。方法5-Aza-CdR处理HT29细胞72 h;RT-PCR检测DLC-1 mRNA的表达;MTT、平板克隆实验、Transwell小室实验分别检测药物处理前后的HT29细胞增殖、侵袭、迁移能力的变化。结果经5-Aza-CdR作用后,HT29细胞DLC-1恢复表达,细胞增殖活性降低,侵袭能力与迁移能力下降。结论5-Aza-CdR可抑制HT29细胞增殖、侵袭、迁移,可能与DLC-1基因恢复表达有关。

ROCK通路在DLC-1基因调控人结肠癌HT29细胞侵袭中的作用

目的观察肝癌缺失基因1(DLC-1)对HT-29细胞侵袭能力的影响。方法用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-DLC-1转染HT-29细胞;应用Rho激酶(ROCK)特异性抑制剂Y27632处理HT-29细胞;Westernblot检测p-MLC蛋白表达;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果野生型HT-29细胞DLC-1基因表达呈阴性,经转染获得DLC-1稳定表达细胞系;与对照组及空载组HT-29细胞相比,转染组和ROCK抑制剂组p-MLC蛋白表达均下调,细胞侵袭能力受到抑制(P<0.05)。结论转染DLC-1基因可能通过抑制ROCK活性,从而抑制HT-29细胞的侵袭能力。

血管活性肠肽对HT29结肠癌细胞系原癌基因c－myc蛋白表达的影响

采用３Ｈ－ＴｄＲ掺入法及免疫组化方法研究了ＶＩＰ对ＨＴ２９细胞生长及ｃ－ｍｙｃ癌基因蛋白表达的影响。结果表明：ＶＩＰ单独可刺激细胞生长，而ＶＩＰ＋ＩＢＭＸ及ｄｂ－ｃＡＭＰ有相反的作用。ＶＩＰ、ｄｂ－ｃＡＭＰ单独对细胞ｃ－ｍｙｃ癌基因蛋白表达无明显影响，ＶＩＰ＋ＩＢＭｘ则抑制ｃ－ｍｙｃ癌基因蛋白的表达。作者认为，ＶＩＰ对ＨＴ２９细胞生长的调节作用与ｃＡＭＰ信使系统密切相关，ｖＩＰ对ＨＴ２９细胞生长的抑制作用至少在部分上是通过抑制ｃ－ｍｙｃ癌基因表达而实现的。

慢病毒介导小干扰RNA沉默人结肠癌HT-29细胞芳香烃受体核转位蛋白基因的研究

目的获取有效沉默人结肠癌HT29细胞的芳香烃受体核转位蛋白基因（ARNT）的短发卡RNA（shRNA）重组慢病毒。方法构建4组表达ARNT—shRNA的慢病毒载体和1组无效干扰慢病毒载体并测序鉴定。用合成的5组重组慢病毒转染HT29细胞，通过克隆稀释扩大培养获取5组稳定转染细胞株，实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）和Westernblot检测沉默效率。结果成功构建4组表达ARNT．shRNA的重组慢病毒，其中1组（LV—ARNT—RNAi一3）转染HT29细胞后能有效沉默ARNT基因，mRNA相对表达下降70％（P〈0．05），蛋白水平表达下降60％（P〈0．05）。结论重组慢病毒LV—ARNT—RNAi一3可以下调人结肠癌HT29细胞ARNT基因的表达。

血管活性肠肽对人结肠腺癌细胞增殖的调节

本文结果表明，血管活性肠肽（ＶＩＰ）可刺激人结肠腺癌ＨＴ２９细胞产生ｃＡＭＰ，呈剂量依赖关系，ＶＩＰ与异丁基甲基黄嘌呤（ＩＢＭＸ）联用刺激作用更强。较低剂量的ＶＩＰ或双丁酰环磷酸腺苷（ｄｂ－ｃＡＭＰ）单独能刺激细胞增殖，而高剂量ＶＩＰ或ｄｂ－ｃＡＭＰ，以及ＷＰ联用ＩＢＭＸ则抑制ＨＴ２９细胞增殖。流式细胞仪分析表明，ＶＩＰ联用ＩＢＭＸ或ｄｂ－ｃＡＭＰ单独可延长细胞Ｇ０／Ｇ１期。