褪黑素对人腹膜间皮细胞上皮-间质转化的作用及机制

目的探讨褪黑素对人腹膜间皮细胞上皮-间质转化(EMT)的作用及机制。方法培养人腹膜间皮细胞株HMrSV5,构建核心蛋白聚糖(DCN)过表达和敲减质粒。将细胞分为正常对照组、TGF-β1组、TGF-β1+褪黑素组、TGF-β1+褪黑素+siDCN组、TGF-β1+褪黑素+siNC组、TGF-β1+DCN组。采用CCK-8法检测细胞增殖存活率;采用蛋白免疫印迹和实时定量PCR检测DCN、TGF-β1、Smad2、E-cadherin蛋白和mRNA表达水平。结果CCK-8结果显示,TGF-β1+褪黑素组、TGF-β1+褪黑素+siDCN组、TGF-β1+DCN组细胞存活率均较TGF-β1组高,TGF-β1+褪黑素组较TGF-β1+褪黑素+siDCN组细胞存活率更高(均P<0.05)。蛋白免疫印迹及实时定量PCR表明,TGF-β1组较对照组DCN和E-cadherin表达明显下调,TGF-β1+褪黑素组与TGF-β1+褪黑素+siDCN组较TGF-β1组DCN、E-cadherin蛋白及mRNA表达上调,TGF-β1、Smad2蛋白及mRNA表达下调;TGF-β1+褪黑素组较TGF-β1+褪黑素+siDCN组进一步上调E-cadherin、DCN蛋白及mRNA表达,进一步下调TGF-β1、Smad2蛋白及mRNA表达(均P<0.05)。结论褪黑素可延缓人腹膜间皮细胞EMT进程,DCN基因可能是抑制该细胞发生EMT的一个重要靶点。

Inhibiting effect of short hairpin RNA on expression of transforming growth factor-β1 in human peritoneal mesothelial cells induced by peritoneal dialysis solution

The peritoneum response to peritoneal dialysis can lead to fibrosis. The transforming growth factor-β1 （TGF-β1） plays an important role in regulating tissue repair and remodeling after injury. Excessive synthesis and deposition of matrix proteins by peritoneal mesothelial cells can lead to structural and functional changes in the peritoneal membrane, jeopardizing the long-term efficacy of peritoneal dialysis （PD）. Prolonged exposure to high glucose concentrations in PD fluid has been implicated as a major stimulus to matrix accumulation, through the induction of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）.

表没食子儿茶素没食子酸酯抑制人腹膜间皮细胞上皮-间质转化的作用及机制

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人腹膜间皮细胞(HPMCs)上皮-间质转化(EMT)的作用及机制。方法收集新开管的腹膜透析和腹膜透析1年以上患者的HPMCs,分别采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法和免疫印迹(Western blot)法检测紧密连接蛋白1(ZO-1)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、铁死亡抑制蛋白1(FSP1)mRNA和蛋白表达水平。采用HPMCs细胞系HMrSV5进行体外实验研究,分别加入20,40,60,80,100μg/mL EGCG,检测EGCG对HMrSV5的细胞毒性。通过200μg/mL和500μg/mL晚期糖基化终产物(AGEs)构建HPMCs EMT模型,将HMrSV5细胞分为对照组(AGEs造模前无处理)、实验组(AGEs造模前2 h加入EGCG共孵育)、si-NC+EGCG组(转染si-NC后,AGEs造模前2 h加入EGCG共孵育)、si-Notch3+EGCG组(转染si-Notch3后,AGEs造模前2 h加入EGCG共孵育),检测ZO-1,E-cadherin,FSP1,Notch3 mRNA和蛋白表达水平。结果与新开管的腹膜透析患者比较,腹膜透析1年以上患者HPMCs的ZO-1及E-cadherin mRNA和蛋白表达水平均显著升高,FSP1及Notch3 mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。与正常HMrSV5比较,加入500μg/mL AGEs诱导HMrSV5后,ZO-1及E-cadherin mRNA和蛋白表达水平均显著升高,FSP1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。与对照组比较,实验组ZO-1及E-cadherin mRNA和蛋白表达水平均显著降低,FSP1及Notch3 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与si-NC+EGCG组比较,si-Notch3+EGCG组Notch3及FSP1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低,ZO-1及E-cadherin mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。腹膜透析患者HPMCs中Notch3表达水平与ZO-1和E-cadherin呈负相关(r=-0.8477,-0.3822,P<0.05),与FSP1呈正相关(r=0.6626,P<0.05)。结论EGCG通过Notch3抑制AGEs诱导的HPMCs EMT,发挥对腹膜透析患者的保护作用。

大蒜素通过JAK2/STAT3信号通路改善高糖诱导的人腹膜间皮细胞-间充质转化

目的探讨大蒜素改善高糖诱导的人腹膜间皮细胞-间充质转化的相关机制。方法培养人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)后将其进行两次分组,分组1:①对照组;②8.5 mmol/L D-葡萄糖诱导组(8.5 mmol/L DG组);③17 mmol/L D-葡萄糖诱导组(17 mmol/L DG组);④34 mmol/L D-葡萄糖诱导组(34 mmol/L DG组);⑤68 mmol/L D-葡萄糖诱导组(68 mmol/L DG组)。其中除对照组外,其余组分别用8.5、17、34、68 mmol/L的D-葡萄糖诱导48 h。分组2:①对照组;②34 mmol/L D-葡萄糖诱导组(HG组);③34 mmol/L D-葡萄糖+低剂量大蒜素诱导组(AL-L组);④34 mmol/L D-葡萄糖+中剂量大蒜素诱导组(AL-M组);⑤34 mmol/L-葡萄糖+高剂量大蒜素诱导组(AL-H组);⑥34 mmol/L D-葡萄糖+JAK2抑制剂诱导组(JAK2组)。其中HG组用34 mmol/L的D-葡萄糖诱导48 h,AL-L组、AL-M组、AL-H组用34 mmol/L的D-葡萄糖预处理6 h后分别用10、20和40 ng/mL大蒜素诱导48 h,JAK2组加入1μmol/L AG490预处理6 h后用34 mmol/L的D-葡萄糖诱导48 h。ELISA检测HPMCs上清的IL-6、TNF-α和IL-1β的含量;CCK-8检测细胞增殖并观察形态;Western blot检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、α-SMA、MCP-1、p65、p-p65蛋白的表达情况。结果与对照组相比,高糖诱导组HPMCs的相对存活率明显降低(P<0.01),细胞形态表现异常,促进上皮细胞-间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发生的α-SMA、N-cadherin和Vimentin表达明显上调,抑制EMT发生的E-cadherin蛋白表达明显下调,JAK2/STAT3信号通路被激活从而导致EMT的发生(P<0.01);而大蒜素能明显促进高糖诱导后的HPMCs增殖,恢复异常的细胞形态,调节与EMT发生的相关蛋白水平从而改善HPMCs的上皮间质转分化;与高糖诱导组相比,大蒜素处理组HPMCs的促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α明显降低,促炎症蛋白p-p50和MCP1表达明显下调,表明大蒜素能改善EMT引起的炎症。结论大蒜素可通过抑制JAK2/STAT3信号通路调节EMT发生的标志蛋白、炎症信号蛋白及炎症因子水平从而改善高糖诱导的EMT及炎症。

黄芪甲苷对高糖腹膜透析液诱导人腹膜间皮细胞表达致纤维化因子的影响

目的观察黄芪甲苷对高糖腹膜透析液(PDS)诱导人腹膜间皮细胞(HPMCs)结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨黄芪甲苷对致纤维化因子的调节作用。方法选用HMrSV5细胞株,培养至第5代,随机分为对照组(10%FBS培养液)、模型组(4.25%PDS和10%FBS培养液)和黄芪甲苷低、中、高剂量组(含黄芪甲苷终浓度为10、20、40μg/mL的4.25%PDS和10%FBS培养液)。采用MTT法检测细胞活性,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液TGF-β1、CTGF、VEGF水平。结果除5μg/mL浓度组外,HPMCs的活性均较空白组不同程度增强,以40、45、50μg/mL浓度组作用较显著(P<0.05);与空白组比较,模型组TGF-β1、CTGF、VEGF表达增加;与模型组比较,黄芪甲苷各组TGF-β1、CTGF、VEGF表达明显减少,呈量效关系(P<0.05)。结论黄芪甲苷通过减少高糖刺激下HPMCs TGF-β1、CTGF、VEGF表达,达到延缓腹膜纤维化的发展。

高糖与炎症因子及黄芪对人腹膜间皮细胞毒性的影响

目的 :研究不同浓度的含糖腹透液、多种炎症因子以及二者的共同作用对人腹膜间皮细胞损伤的影响 ,并探索中药黄芪对此的干预作用。方法 :用乳酸脱氢酶 (LDH)释放法测定细胞毒性 ,观察各种因素 (不同浓度的含糖腹透液与炎症因子的组合、多种炎症因子及其组合和中药黄芪 )对体外培养人腹膜间皮细胞株损伤的影响。结果 :4 .2 5 %腹透液使细胞破坏明显增加 ,P <0 .0 5 ;4 .2 5 %腹透液 +TNF -α或 (LPS +TNF -α +IL - 1β)进一步加剧细胞损伤 ,P <0 .0 5和P <0 .0 1。黄芪明显减少细胞破坏 ,在 1.5 %腹透液情况下 ,P <0 .0 0 1;在TNF -α和LPS +TNF -α+IL - 1β情况下 ,P <0 .0 5。结论 :黄芪减少腹膜间皮细胞损伤 ,在炎症因子或含糖腹透液条件下 。

Troglitazone对人腹膜间皮细胞TGF-β_1和纤维连接蛋白表达的影响

目的:研究过氧化物增生体激活受体γ(PPAR-γ)激动剂troglitazone(曲格列酮,TGZ)对高浓度葡萄糖刺激下体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMCs)中TGF-β1和细胞外基质纤维连接蛋白(Fn)表达的影响。方法:采用胰蛋白酶消化法从人大网膜组织中分离间皮细胞,建立稳定的体外培养模型。根据细胞增殖与毒性实验选择troglitazone的最佳浓度15μmol/L,干预高浓度葡萄糖(30mmol/LD-葡萄糖)刺激下的人腹膜间皮细胞。采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)半定量检测HPMCs中PPAR-γ,TGF-β1以及Fn的 mRNA表达;采用双抗夹心法酶联免疫吸附实验检测HPMCs培养液中TGF-β1蛋白质水平;Western印迹检测Fn蛋白质水平。结果:高糖(30mmol/LD-葡萄糖)刺激可在 mRNA和蛋白质水平明显上调HPMCs表达TGF-β1和Fn(P<0.01),troglitazone干预高糖孵育的HPMCs,可使TGF-β1和Fn mRNA和蛋白质的表达明显下调(P<0.05)。结论:Troglitazone能够明显抑制在高糖刺激下的HPMCsTGF-β1和Fn的表达,这可能为临床防治长期腹膜透析患者的腹膜纤维化提供一种较为有效的方法。

细胞内活性氧在甲基乙二醛促人腹膜间皮细胞分泌血管内皮生长因子中的作用

目的:观察葡萄糖降解产物甲基乙二醛(MGO)对人腹膜间皮细胞(HPMC)分泌血管内皮生长因子(VEGF)的影响及细胞内活性氧(ROS)在其中的作用。方法:分别用不同浓度的MGO及抗氧化剂N-酰-L-半胱氨酸(NAC)作用于细胞,用RT-PCR和ELISA方法测定HPMC中VEGF的表达;再以氧化敏感的荧光染料2、7-二氢二氯荧光素(DCFH)染色,流式细胞仪测定细胞内ROS强度。结果:MGO能使细胞内ROS水平明显升高,呈浓度依赖效应;MGO同时以时效和量效方式促进HPMC中VEGF的表达;而NAC能够明显抑制MGO导致的细胞内ROS升高,同时抑制HPMC中VEGF的分泌。结论:MGO可能部分通过诱导细胞内ROS,促进HPMC表达VEGF,从而引起腹膜新生血管的增加,最终导致腹膜失超滤现象。

葡萄糖PDS对单层人腹膜间皮跨细胞电阻及迁移修复能力的影响

目的:观察不同浓度葡萄糖PDS(PDS)对单层人腹膜间皮细胞(HPMCs)跨细胞电阻(TER)以及迁移修复能力的影响。方法:用不同葡萄糖浓度PDS(1.5%,2.5%,4.25%)分别与DMEM以1:1比例混合后体外培养HPMCs。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖。使用双池培养皿(transwell)构建HPMCs单层细胞模型。采用TER技术测定PDS对HPMCs通透性的影响。划痕损伤实验观察葡萄糖对HPMCs修复再生能力的影响。结果:不同浓度葡萄糖PDS(1.5%,2.5%,4.25%)干预均可明显地抑制HPMCs的增殖(P<0.05)。TER值随PDS干预时间的延长而逐渐下降,且与葡萄糖浓度呈负相关(P<0.01)。葡萄糖PDS可明显抑制HPMCs迁移修复能力,且与葡萄糖浓度相关。结论:高糖PDS液抑制细胞增殖,降低单层HPMCs的TER值,并抑制HPMCs损伤后迁移修复能力。提示PDS中高糖成分是导致腹透患者腹膜高通透性和超滤衰竭的重要因素。

丹参酮ⅡA对腹膜透析液诱导的人腹膜间皮细胞转分化及致纤维化因子表达的影响

目的腹膜纤维化是长期腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)的常见并发症,也是透析不充分和退出PD的主要原因,研究表明丹参酮ⅡA能改善各种组织中的纤维化。文中研究丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对在高糖腹膜透析液(peritonealdialysis fluid,PDF)诱导下体外培养的人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)纤维化及其相关因子表达的影响。方法选择非尿毒症、非糖尿病择期手术患者的大网膜作为HPMCs的来源,将培养的细胞随机分成4组:对照组、PDF组、丹参酮1组(含丹参酮ⅡA浓度为50μmol/L的PDF组)、丹参酮2组(含丹参酮ⅡA浓度为100μmol/L的PDF组),同步培养72h后,应用间接免疫荧光法检测α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)表达,实时荧光定量PCR检测E-cadherin、α-SMA、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原酶(CollagenⅠ)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、smad2、smad7 mRNA表达。结果免疫荧光法发现,丹参酮ⅡA能显著抑制高糖诱导的E-cadherin低表达和α-SMA高表达。Real-time-PCR发现,添加丹参酮ⅡA的PDF组α-SMA、FN、CollagenⅠ、TGF-β1、smad2 mRNA表达与PDF组比较显著下调(P<0.05);E-cadherin、smad7 mRNA表达显著上调(P<0.05)。结论在PDF中添加丹参酮ⅡA可显著减轻PDF导致的HPMCs转分化,从而抑制纤维化相关因子的表达。

乳酸盐腹膜透析液对人腹膜间皮细胞凋亡及bcl-2、bax表达和caspase-3活性的影响

目的:探讨不同浓度乳酸盐腹膜透析液(L-PDS)对腹膜间皮细胞(HPMC)凋亡和bcl-2、bax表达及caspase-3活性的影响。方法:采用酶消化法从人腹膜组织中分离间皮细胞,建立稳定的体外培养模型,分别用浓度为1.50%、2.50%和4.25%的L-PDS与HPMC共同培养,同时设对照组。采用流式细胞术检测HPMC凋亡,采用RT-PCR法测定bcl-2及bax mRNA的表达,采用免疫荧光法检测caspase-3的活性。结果:与对照组比较,L-PDS各组HPMC凋亡率增加,bcl-2 mRNA的表达降低,bax mRNA表达升高,caspase-3活性增加,上述指标变化中2.50%及4.25%L-PDS组与对照组比较差异有显著性(P<0.05),4.25%L-PDS组与2.50%L-PDS组比较差异也有显著性(P<0.05),而1.50%L-PDS组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。结论:L-PDS可诱导HPMC凋亡,其机制可能是通过对bcl-2及bax mRNA表达的改变以及激活caspase-3活性而实现。

pcDU_6质粒载体介导的TGFβ_1 shRNA抑制TGFβ_1在人腹膜间皮细胞中的表达

目的 :研究pcDU6质粒载体介导的转化生长因子β1短发夹RNA(shorthairpinRNA ,shRNA)对人腹膜间皮细胞 (HPMCs)转化生长因子 β1(TGFβ1)表达的影响。方法 :针对TGFβ1的以GGCC开始的 2 1碱基大小的片段 ,分别设计 2对寡核苷酸 ,形成双链后将其依次连入带有U6启动子的 pcDNA3.1( )载体 (命名为 pcDU6) ,2对DNA双链通过BamHI酶切位点连接后形成中间由 6碱基序列间隔的反向互补序列 ,构建成TGFβ1短发夹RNA的产生质粒。采用胰蛋白酶消化法从人腹膜组织中分离间皮细胞 ,建立稳定的体外培养模型。用脂质体转染表达转化生长因子β1shRNA的pcDU6载体质粒和表达反义TGFβ1RNA的pcDNA3.1( )的载体质粒入 4 .2 5 %D 葡萄糖和LPS刺激下人腹膜间皮细胞。采用逆转录多聚酶链式反应 (RT PCR)半定量分析HPMC中TGFβ1mRNA的表达。采用双抗夹心法酶联免疫吸附实验检测HPMC培养液中TGFβ1蛋白质水平。结果 :HPMC在 4 .2 5 %D 葡萄糖和LPS的刺激下可明显上调TGFβ1的表达 (P <0 .0 1)。pcDU6载体质粒介导的转化生长因子 β1shRNA干扰组较 pc DU6空载体组明显下调TGFβ1的表达 (P <0 .0 1)。pcDU6载体质粒介导的转化生长因子 β1shRNA干扰组间比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;pcDNA3.1( )的载体质粒介导的反义RNA组与

高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞NLRP3-IL-1β的影响

目的:观察高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞NLRP3-IL-1β的影响。方法:体外培养人腹膜间皮细胞株第5~10代[HMr SV5,DMEM/F12培养基含10%(体积分数)胎牛血清],观察1.5%、2.5%、4.25%(质量分数)葡萄糖腹膜透析液(dextrose)及线粒体呼吸链复合酶Ⅰ抑制剂鱼藤酮(rotenone),线粒体呼吸链复合酶Ⅱ抑制剂噻吩甲酰三氟丙酮(thenoyltrifluoroacetone,TTFA),线粒体呼吸链复合酶Ⅲ抑制剂抗霉素A(antimycin A)对细胞IL-1β表达的影响(免疫印迹);通过小RNA干扰技术下调NLRP3的表达,免疫印迹分析4.25%高糖腹膜透析液作用下细胞IL-1β的表达;通过白藜芦醇(resveratrol,RSV)诱导自噬,3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、自噬相关蛋白5(autophagy related gene 5,ATG5)siRNA、自噬相关蛋白(Beclin1)siRNA抑制自噬,流式细胞仪分析细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS),免疫印迹分析IL-1β的表达。结果:对照组、1.5%高糖腹膜透析液、2.5%高糖腹膜透析液、4.25%高糖腹膜透析液、鱼藤酮(10μmol/L)、抗霉素A(50 mg/L)、噻吩甲酰三氟丙酮(10μmol/L)各组细胞上清IL-1β的相对表达依次为0、0.175±0.082、0.418±0.163、2.357±0.288、2.642±0.358、3.271±0.462、0.123±0.091,提示2.5%高糖腹膜透析液、4.25%高糖腹膜透析液、鱼藤酮、抗霉素A作用细胞IL-1β表达明显升高,应用NLRP3 siRNA可阻断上述效应;此外,对照组、阴性对照siRNA(negative control,NC siRNA)、RSV(50μmol/L,诱导自噬)、3-MA(10 mmol/L,抑制自噬)、ATG5 siRNA(抑制自噬)、Beclin1 siRNA(抑制自噬)各组总线粒体荧光强度分别为1.76±0.42、1.83±0.55、1.85±0.62、7.36±0.92、5.35±0.77、5.06±0.62,超氧化线粒体荧光强度分别为821.68±95.12、868.15±102.82、723.39±92.56、1 660.08±113.65、1 433.01±107.24、1 562.36±112.88,结合免疫印迹结果,提示抑制自噬可增强线粒体ROS产生和提高IL-1β表达,诱导自噬对ROS、IL-1β无明显影响。结论:长期应用高糖腹膜透析液,腹膜间皮细胞NLRP3-IL-1β持续激活,实时启动自噬可能成为干预NLRP3-IL-1β持续激活、延缓腹膜透析腹腔慢性炎症及腹膜纤维化的治疗靶点。

lnc-MGC对高糖诱导的人腹膜间皮细胞转分化的影响

目的探索长链非编码RNA-MGC(lnc-MGC)在高糖诱导的人腹膜间皮细胞(HPMCs)转分化中的作用。方法使用永生化的HPMCs,设置对照组及高糖组,对照组给予常规培养基培养,高糖组给予含60mmol/L葡萄糖的常规培养液培养72h。采用Real-time PCR检测两组lnc-MGC的表达变化,并采用Real-time PCR及Western bloting检测两组上皮细胞E-钙黏蛋白(E-Cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-1)和Ⅲ型胶原蛋白(COL-3)mRNA及蛋白表达的变化。采用慢病毒转染HPMCs,上调和下调lnc-MGC后,分别观察上述指标的变化。结果高糖刺激HPMCs 72h后,Real-time PCR检测结果显示:与对照组相比,高糖组lnc-MGC及α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3 mRNA表达水平均明显增加(P<0.05),E-Cadherin mRNA表达水平明显降低(P<0.05);Western blotting检测结果显示其蛋白表达与mRNA表达变化趋势一致,差异均有统计学意义(P<0.05)。此外,Real-time PCR检测结果还显示,与对照组相比,慢病毒转染下调lnc-MGC后,lnc-MGC、α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3的表达明显降低(P<0.05),E-Cadherin的表达明显升高(P<0.05);Western blotting检测结果显示其蛋白表达与mRNA表达变化趋势一致,差异均有统计学意义(P<0.05)。而慢病毒转染上调lnc-MGC后,Real-time PCR检测结果显示,与对照组相比,lncMGC、α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3的表达增加(P<0.05),E-Cadherin的表达降低(P<0.05);Western blotting检测结果显示其蛋白表达与mRNA表达变化趋势一致,差异均有统计学意义(P<0.05)。采用mi RBase数据库预测所得lncRNA下游靶分子为miRNA126-3p,与对照组相比,高糖刺激后miRNA126-3p表达明显升高(P<0.05),转染下调lnc-MGC的慢病毒后miRNA126-3p表达明显降低(P<0.05),转染上调lnc-MGC的慢病毒后miRNA126-3p表达明显升高(P<0.05)。结论lnc-MGC通过调控miRNA126-3p参与HPMCs的转分化过程,调控lnc-MGC的表达可以改变HPMCs的表型转换,并有可能延缓腹膜纤维化的发展。

不同浓度钙离子对人腹膜间皮细胞E－钙黏蛋白、成纤维细胞特异蛋白、波形蛋白表达的影响

目的:观察钙浓度变化对人腹膜间皮细胞上皮细胞-间充质细胞转分化的影响,探讨腹膜透析中腹膜纤维化的可能机制。方法:以人腹膜间皮细胞永生化细胞株(HMrSV5)为研究对象,予不同浓度钙(0.25、0.75、1.25、1.75、2.25mmol/L)处理细胞48h,以不含钙处理组为对照。采用蛋白免疫印迹和间接免疫荧光染色方法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、成纤维细胞特异蛋白(fibroblast specific protein,FSP1)和波形蛋白(Vimentin)的表达。结果:不含钙组HMrSV5细胞基本不表达E-cadherin,极低水平表达Vimentin和FSP1;而予含不同浓度钙离子处理48h后,HMrSV5中E-cadherin先呈剂量依赖性上调,1.25mmol/L组至顶峰,再呈剂量依赖性下降;而Vimentin和FSP1均在1.75mmol/L组HMrSV5中明显升高(P<0.05)并呈剂量依赖性上调。间接免疫荧光染色结果也显示,高钙组Vimentin和FSP1荧光强度比低钙组显著增强。结论:钙离子浓度的变化能诱导人腹膜间皮细胞E-cadherin、FSP1、Vimentin蛋白表达发生变化,提示钙离子可能是参与调控间皮细胞间充质转分化的一个重要因素。

黄芪注射液对腹膜透析相关腹膜间皮细胞TGF-β_1分泌与表达的影响

目的:探讨黄芪对腹膜透析相关性腹膜纤维化的作用。方法:人腹膜间皮细胞(HPMC)做体外培养,第三代细胞用于实验。分5组观察,对照组为RP-MI1640;PDS(peritoneal dialysis solution,腹膜透析液)组为加入PDS;黄芪12、3、组为加入含黄芪注射液的PDS,黄芪终浓度分别为102、04、0 mg.ml-1。分别在24 h采用ELISA法检测细胞上清液中转移生长因子-1β(TGF-1β)的含量,采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测TGF-1βmRNA表达。结果:腹膜间皮细胞在PDS干预下分泌TGF-1β明显增加(P<0.05)。腹膜间皮细胞经含不同浓度黄芪注射液的PDS干预后,TGF-1β分泌与PDS组比较有显著下降(P<0.05)。不同浓度黄芪注射液组之间比较无显著差异(P>0.05)。腹膜间皮细胞在PDS干预下TGF-1βmRNA表达明显升高,比对照组上升62.43%,腹膜间皮细胞经含不同浓度黄芪注射液的PDS干预后,TGF-1βmRNA表达显著低于PDS组(P<0.01)。结论:商业性腹膜透析液可促进腹膜间皮细胞分泌和表达TGF-1β,黄芪可以部分抵消这一作用所致的腹膜透析相关性腹膜纤维化。

人腹膜间皮细胞的分离培养

目的体外培养的人腹膜间皮细胞（ＨＰＭＣ）是研究腹膜功能的有用模型，我们为此建立了一种改良消化法，以从人大网膜分离腹膜间皮细胞。方法用０．２％胰蛋白酶－０．０２％ＥＤＴＡＮａ２消化人大网膜组织碎片，细胞悬液经１００目筛网滤过后进行培养：瑞士姬姆萨染色观察细胞形态，计算细胞纯度：免疫组化（ＡＢＣ法）鉴定细胞。结果分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状，纯度达９５％以上。细胞表面标志鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性，第Ⅷ因子相关抗原、白细胞ＣＤ４５抗原阴性，证实分离培养的确是ＨＰＭＣ。结论胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离ＨＰＭＣ的方法。

黄芪甲苷对高糖腹透液诱导的腹膜间皮细胞线粒体损伤的干预机制研究

目的研究黄芪甲苷对高糖腹透液诱导的人腹膜间皮细胞(HPMCs)线粒体损伤的影响,并探讨其干预机制.方法①人腹膜间皮细胞株(HMrSV5)在RPMI 1640(含1%FCS)培养液中培养24 h后分为6组:空白组:正常培养液2 mL;高糖腹透液组:含4.25%PDS 1 mL+正常培养液1 mL;低剂量黄芪甲苷组:黄芪甲苷剂量终浓度10μmol/mL;中剂量黄芪甲苷组:黄芪甲苷剂量终浓度20μmol/mL;高剂量黄芪甲苷组:黄芪甲苷剂量终浓度40μmol/mL;阳性药对照组:吡菲尼酮50μmol/mL.②分别采用CCK-8法测定HMrSV5的增殖活性;流式细胞仪检测细胞活性氧族(ROS)水平变化;罗丹明123荧光染色检测HMrSV5膜电位水平变化;JC-1法测定HMrSV5线粒体膜电位的去极化;Western blot检测HPMCs线粒体形态和功能相关蛋白的表达情况.结果①CCK-8检测结果显示,与模型组相比,黄芪甲苷处理组OD值明显升高,细胞存活率也相应增加,呈浓度依赖性,黄芪甲苷对HPMCs有保护作用;②流式检测提示高糖腹透液刺激后线粒体ROS产生增加,而黄芪甲苷可有效降低ROS水平;③JC-1和罗丹明123染色后流式检测发现随着黄芪甲苷浓度的增加,线粒体膜电位的去极化程度随之减少,同时有效增加线粒体膜电位,线粒体膜通透性降低,黄芪甲苷能部分修复高糖腹透液对线粒体的损伤;④Western blot检测结果显示,黄芪甲苷处理的细胞线粒体分裂蛋白DRP1、FIS1的表达水平明显降低,线粒体外膜结合蛋白OPA1、TOM70的表达水平明显升高.结论①高糖腹透液能诱导HPMCs线粒体损伤模型;②黄芪甲苷能够通过促进HPMCs线粒体外膜OPA1、TOM70蛋白的表达,降低DRP1、FIS1蛋白表达水平,减少线粒体膜电位去极化,同时有效增加膜电位及降低线粒体膜通透性,进而改善高糖腹透液诱导的HPMCs线粒体氧化应激损伤,保护其结构功能的稳定.

川芎嗪对高糖诱导后人腹膜间皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的研究川芎嗪对体外培养的人腹膜间皮细胞在高糖刺激下血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法体外培养人腹膜间皮细胞,分为5组(每组设3个样本):正常对照组(完全培养液)、高糖对照组(2.5%葡萄糖)和高糖(2.5%葡萄糖)加川芎嗪(浓度依次为10,20,40 mg/L)组。采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞内VEGF mRNA的表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液中VEGF的蛋白质水平,用二喹啉甲酸蛋白检测法测定细胞中蛋白质含量,用以校正ELISA结果。结果川芎嗪能显著降低高糖所致的人腹膜间皮细胞VEGF的表达(P<0.01);两者在蛋白质和基因水平均呈量效关系。结论川芎嗪可以减少高糖刺激下人腹膜间皮细胞VEGF的表达,从而达到延缓腹透相关性腹膜纤维化的发生和发展。

高糖对人腹膜间皮细胞氧化应激的影响

目的研究不同浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)氧化应激的影响。方法HPMC体外培养并行免疫组化鉴定,取第2代细胞用于实验。将不同浓度葡萄糖干预HPMC一定时间后,MTT比色法检测细胞活力;采用活性氧捕获剂双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)孵育细胞,通过流式细胞仪检测细胞内的荧光强度而测得细胞内活性氧(ROS)水平。分析不同浓度葡萄糖及不同作用时间对HPMC细胞活力及ROS水平的影响。结果高糖明显抑制HPMC细胞活力(P<0.05),随着葡萄糖浓度增加及作用时间的延长,抑制率呈上升趋势。高糖干预HPMC后,细胞内的平均荧光强度明显升高。结论高糖导致细胞发生氧化应激,其对细胞的损伤作用可能与氧自由基生成过多及ROS蓄积有关。