麦粒灸通过IκBα缓解环磷酰胺小鼠脾脏损伤

目的基于NF-κB信号通路分析麦粒灸对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影响,探讨麦粒灸对免疫功能的调节机制。方法60只SPF级ICR小鼠随机分为空白组、模型组、中药组、麦粒灸组,各15只。空白组腹腔注射生理盐水0.2 ml,其余各组小鼠连续3 d腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg造模;麦粒灸组在“大椎”“足三里”“三阴交”进行施灸,中药组给予贞芪扶正颗粒灌胃,每日1次连续7 d。后取材,HE法观察小鼠脾脏形态学变化,ELISA法检测血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ水平,Western blot检测IκBα、P-IκBα的蛋白表达水平。结果与空白组相比,模型组小鼠一般状况较差;白细胞(WBC)计数降低(P<0.01);脾脏组织出现很大程度损伤;血清中IL-4、IL-2水平降低,TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.01);脾脏组织P-IκBα蛋白的表达显著降低(P<0.01),而IκBα蛋白的表达高于空白组(P<0.01)。与模型组相比,麦粒灸组、中药组一般状况得到改善;WBC计数明显升高(P<0.01);脾脏损害程度有所减轻;血清中IL-4、IL-2水平升高,TNF-α、IFN-γ水平降低(P<0.01);P-IκBα蛋白的表达有不同程度的升高(P<0.01),IκBα蛋白的表达有所降低(P<0.01)。与中药组相比,麦粒灸组小鼠WBC计数略高(P<0.05),脾脏组织状况较好,IFN-γ蛋白水平较低(P<0.01)。结论麦粒灸可通过调节IκBα和P-IκBα的相对表达,影响NF-κB信号通路的活性,进而调节机体免疫应答反应,对环磷酰胺所致的免疫抑制起到缓解作用。

烙灸对兔激素性股骨头坏死组织中IKKβ、IκBα表达的影响

目的探讨烙灸治疗早期激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH)的作用机制。方法将新西兰兔按随机数表法分为空白组、模型组、烙灸组、抑制剂组,每组6只,采用内毒素联合激素的方法制备SONFH模型。烙灸组进行4周的烙灸治疗,抑制剂组给予IκBα磷酸化抑制剂Bay11-7082(1 mg·kg-1)腹腔注射3周。干预前后分别观察实验兔一般状况变化;HE染色观察各组实验兔股骨头组织病理学变化;Western blot和RT-qPCR分别检测股骨头组织中IKKβ、磷酸化IκBα(p-IκBα)蛋白及mRNA的表达变化;ELISA检测血清中核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平。结果与空白组比较,模型组实验兔逐渐出现精神萎靡、毛发暗淡等情况,股骨头组织骨小梁出现断裂、稀疏等改变,IKKβ、p-IκBα蛋白水平,IKKβmRNA水平及血清中NF-κB、TNF-α、IL-6水平均升高(P均<0.05);与模型组比较,烙灸组股骨头组织病理学改善,IKKβ、p-IκBα蛋白水平,IKKβmRNA水平及血清中NF-κB、TNF-α、IL-6水平均降低(P均<0.05),而IκBα蛋白及mRNA表达均升高(P均<0.05)。结论烙灸可改善早期SONFH骨代谢,缓解骨坏死,其机制与抑制TLR4/NF-κB通路有关。

重组腺病毒IκBαM抑制高糖诱导的血管内皮细胞炎症因子的异常分泌

构建携有核因子κB抑制物IκBα的突变体IκBαM的重组腺病毒(AdIκBαM),并感染ECV304血管内皮细胞,采用Westem blot、电泳迁移率变动分析和逆转录-聚合酶链反应等方法研究核因子κB在高浓度葡萄糖刺激的ECV304细胞分泌功能中所起的作用以及阻断其活性对内皮细胞分泌功能的影响。结果发现,高糖能诱导ECV304细胞IκBα的降解和核因子κB的激活,同时上调炎症因子细胞间粘附分子1、单核细胞趋化蛋白1和内皮素1 mRNA表达水平,而感染AdIκBαM的ECV304/IκBαM细胞则能拮抗高糖所致的IκBα降解与核因子κB激活,同时下调这些炎症因子的异常分泌水平。结果提示,核因子κB的激活在高糖所致的内皮细胞分泌功能改变中起中轴作用,抑制核因子κB的活化,有助于改善血管内皮细胞功能。

衰老大鼠淋巴细胞磷酸化p65,IκBα,IκBε表达特点及淫羊藿总黄酮的干预研究

目的:研究衰老状态下脾淋巴细胞磷酸化p65,IκBα,IκBε的表达特点,并探讨淫羊藿总黄酮(EF)的干预作用。方法:将SD大鼠随机分为4月龄(4 m)、27月龄(27 m)、27 m+EF组,其中检测IκBε,IκBα时,对27 m及27 m+EF组均用NF-κB信号通路抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC),进行NF-κB阻断(即27 m PDTC及27m PDTC+EF组)。以SD大鼠脾脏分离的淋巴细胞为研究对象,采用Western-blot方法,分别比较检测各组淋巴细胞磷酸化p65,IκBε,IκBα的差异表达。结果:衰老状态下,RelA(p65)、磷酸化p65,IκBα,IκBε的表达与青年组对比,均明显降低,对27 m组进行PDTC阻断后则愈加明显。而加用EF干预后,老年各组的以上指标表达均可明显上调。结论:衰老大鼠淋巴细胞中p65,IκBα,IκBε磷酸化蛋白表达明显不足,EF能够显著上调衰老状态下以上蛋白的表达。

NF-κB超抑制物IκBαM重组腺病毒的构建

目的 在克隆IκBα基因并构建IκBαM的基础上 ,构建重组腺病毒AdIκBαM。方法 将IκBαM克隆至穿梭质粒 ,线性化后与骨架质粒共同转染BJ5 183菌 ,构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定 ;将其线性化后转染 2 93细胞 ,观察绿色荧光以确定转染结果 ,以Westernblot法检测目的基因表达。结果 凝胶电泳及行酶切鉴定表明同源重组成功 ;PCR产物测序证明确为IκBαM ;以重组腺病毒质粒转染 2 93细胞 ,见绿色荧光 ;感染 2 93细胞得到大量病毒。结论 成功构建了IκBαM重组腺病毒 。

阿魏酸钠对缺氧致脑血管内皮细胞NF-κB、IκBα表达的影响

目的研究阿魏酸钠对缺氧脑血管内皮细胞核转录因子κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)及IκBα表达的影响。方法建立大鼠脑皮质微血管内皮细胞(brainmicrovascularendothelialcell,BMEC)体外培养模型,并施加12h缺氧条件,分为对照组、缺氧组、阿魏酸钠组。应用MTT法测定细胞活性,采用放射免疫方法测定内皮素(endothelin-1,ET-1)含量,采用免疫细胞化学法检测BMEC的NF-κB及IκBα表达。结果阿魏酸钠(100μg/ml)能抑制缺氧诱导的ET-1释放(P<0.01)。缺氧刺激血管内皮细胞NF-κB的表达,降低IκBα的表达,阿魏酸钠可以显著抑制缺氧内皮细胞中NF-κB的表达及核移位现象,增加IκBα的表达和BMEC活性。结论阿魏酸钠对大鼠脑皮质BMEC缺氧损伤具有保护作用,机制与其减少BMEC分泌ET-1,抑制NF-κB蛋白表达,促进IκBα蛋白表达有关。

姜黄素通过下调IκBα磷酸化抑制食管鳞癌细胞的体外增殖

目的探讨姜黄素是否能够通过下调IκBα的磷酸化而抑制食管鳞癌细胞的增殖并对其细胞周期产生影响。方法 MTT法检测姜黄素作用下食管鳞癌细胞的增殖;Western blot法检测EC9706和Eca109细胞在姜黄素作用下pIκBα和细胞周期蛋白cyclin D1的表达情况。两种细胞中加入姜黄素培养72 h,或联合5-FU培养72 h,流式细胞仪检测细胞周期。结果 EC9706和Eca109细胞的存活率均随着姜黄素浓度的增加逐渐下降;姜黄素作用下EC9706和Eca109细胞中pIκBα和cyclin D1蛋白的表达水平随着时间的延长逐渐下降,且G0/G1期的细胞开始增加,S期的细胞逐渐减少;当姜黄素联合使用5-FU时,G0/G1期的细胞明显增加,S期的细胞明显减少。结论 姜黄素通过下调IκBα及cyclin D1的表达而抑制食管鳞癌细胞的增殖,或许有望成为食管癌治疗中的一个辅助用药。

食管鳞癌细胞中NF-κB与IκBα的mRNA、蛋白表达

目的:核转录因子NF-kappaB(NF-κB)是一种重要的转录因子,参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。本研究通过检测食管鳞癌细胞中NF-κB与IκBαmRNA、蛋白的表达及NF-κB的DNA结合活性,分析NF-κB在食管鳞癌细胞中的激活状态及其在食管鳞癌细胞的生存及转化中的作用。方法:采用West-ernblotting法检测两株食管鳞癌细胞胞质中NF-κB亚单位p50和p65、阻遏物IκBα及其磷酸化IκBα的蛋白表达,检测细胞核中p50和p65的蛋白表达并采用EMSA法检测其与DNA的结合活性。使用RT-PCR法检测p50、p65、IκBαmRNA的表达。结果:NF-κB的亚单位p50、p65、IκBα及磷酸化IκBα在食管鳞癌细胞质中均表达,p50、p65蛋白在细胞核中也表达并具有较高的DNA结合活性。RT-PCR结果表明,p50、p65、IκBα的mRNA在细胞中也存在过表达。结论:本研究发现NF-κB在两株食管鳞癌细胞系中被激活,基因的过表达及IκBα的磷酸化在维持NF-κB的活化中起着重要的作用。

腺病毒介导IκBα基因在体外培养U_(937)细胞中的表达及效应研究

目的 通过构建IκBα基因的腺病毒表达载体 ,并用急性相反应蛋白SAA3 启动子来指导目的基因IκBα的表达 ,体外观察在炎性刺激后IκBα蛋白的诱导性表达特性及对NF κB活性的调控作用 ,对炎症介质产生的抑制效应。方法 采用DNA重组与同源重组技术 ,构建含只响应病理信号的启动子 急性相反应蛋白启动子SAA3 、目的基因IκBα的炎症诱导性复制缺陷型重组腺病毒载体 (AdIκBα)。应用AdIκBα,选择在炎症反应中具有代表意义的巨噬细胞 ,观察AdIκBα在体外培养巨噬细胞U93 7中诱导性表达IκBα(Westernblot)、对NF κB活性的调控 (EMSA)及体外效应。结果 ①成功构建炎症诱导性IκBα表达质粒 (pAdpLplSAA3 NLSIκBα) ,该表达框含SAA3 启动子 ,SV40 大T抗原核定位信号 (NLS) ,IκBαcDNA和ployA ;②pAdpLpLSAA3 NLSIκBα质粒与pJM1 7同源重组 ,脂质体 (DOTAP)介导 ,共转染入 2 93细胞。PCR法筛选阳性克隆 ,获得重组腺病毒 (AdIκBα) ;③用 2 93细胞扩增AdIκBα;采用反复冻融法纯化腺病毒 ,获得高滴度 (5× 1 0 1 0 pfu/ml)重组腺病毒 ;④体外实验 ,用 50MOIAdIκBα预感染体外培养的U93 7细胞 ,再用LPS攻击后 ,该腺病毒诱导性表达IκBα蛋白 (Westernblot) ,且表达的IκBα能抑制NF κB的活化 (EMSA)

中国人IκBα基因的克隆和序列分析

目的克隆中国人IκBα基因，了解其与欧美人种有无不同, 为进一步的研究工作打下基础。方法从中国人外周血中分离单个核细胞，刺激细胞贴壁30 min后 提取总RNA。应用RT-PCR法扩增目的基因，胶回收法纯化。将其连接到pGEM-T质粒载体，进行测序并与已知IκBα 序列进行同源性分析。结果中国人IκBα基因与genebank中发表的人IκB α基因序列仅2个碱基不同且所编码氨基酸无改变。结论我们已成功克隆了中国人IκBα基因 。同源性分析表明，其与 genebank中所报道的基因序列基本一致。

核转录因子κBp65蛋白及其抑制蛋白IκBα表达与食管鳞癌浸润转移的关系

目的:探讨核转录因子κB(NF-κB)p65蛋白及其抑制蛋白IκBα表达与食管鳞癌浸润转移的关系。方法:用免疫组化SP法检测了61例食管鳞癌中NF-κBp65、IκBα蛋白的表达。结果:p65、IκBα蛋白的胞浆表达与食管鳞癌的组织学分级、浸润深度和淋巴结转移无关,但p65蛋白的胞核表达与食管鳞癌的组织学分级、浸润深度和淋巴结转移均呈正相关(P值均<0.01),IκBα蛋白的胞核表达与食管鳞癌的淋巴结转移有关(P<0.05)。在食管鳞癌中IκBα蛋白的胞浆和胞核阳性率均高于p65蛋白,但差异均无统计学意义,也无相关关系。结论:NF-κBp65蛋白的胞核表达与食管鳞癌的分级、浸润和淋巴结转移有关,IκBα蛋白的胞核表达与食管鳞癌的淋巴结转移有关。

基于NF-κB/IκBα信号通路探讨“通经利浊”针法对急性痛风性关节炎大鼠保护作用的机制研究

目的本研究旨在探讨"通经利浊"针法对急性痛风性关节炎大鼠潜在的保护机制。方法模型组通过注射单钠尿酸盐(MSU)诱发大鼠急性痛风性关节炎。治疗组对大鼠进行"通经利浊"针法针刺治疗7 d,对照组口服秋水仙碱(1 mg/kg)给药7 d。结果实验结果表明,注射MSU可显著提高血清促炎细胞因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平,应用"通经利浊"针法针刺治疗效果显著逆转(P<0.05);通过组织病理学检查,进一步明确了"通经利浊"针法的疗效,并对其保护作用机制进行了研究,结果表明"通经利浊"针法针刺抑制了MSU诱导的核因子κB(NF-κB)通路的激活。MSU诱发后,"通经利浊"针法针刺显著抑制了NF-κB p65的活化和蛋白κB-α(IκBα)的降解。结论"通经利浊"针法针刺可能通过抑制NF-κB/IκBα信号通路的激活从而起到对MSU诱发的急性痛风性关节炎的保护作用。

山香圆总黄酮对慢性咽炎模型大鼠NF-κB、IκBα表达的影响

以2.5%氨水喷咽部建立大鼠慢性咽炎模型,用HE染色法观察咽部病理形态学改变,用ELISA法检测血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6,用RT-qPCR测定咽部组织NF-κBp65mRNA的表达,用Western blot检测咽部组织NF-κBp65和IκBα蛋白的表达,探讨山香圆总黄酮对慢性咽炎模型大鼠NF-κB、IκBα表达的影响.结果显示:山香圆总黄酮能明显改善模型大鼠咽部病理形态学;与模型组比较,山香圆总黄酮各组能不同程度地下调TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-κBp65的表达并上调IκBα的表达,其中高剂量组最显著.这表明山香圆总黄酮能通过抑制NF-κB的表达和IκBα的解离下调炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,从而减轻炎症,发挥抗慢性咽炎作用.

阿魏酸通过抑制MAPK和NF-κB/IκBα信号通路减轻大鼠肝纤维化的机制研究

目的探讨阿魏酸抗肝纤维化作用的潜在机制。方法检测阿魏酸对肝纤维化和肝功能指标以及抗氧化应激酶活性的影响。结合炎症相关因子和肝星状细胞(HSC)激活标志物水平检测结果,发现阿魏酸能有效抑制HSC的激活、氧化应激和炎症反应。免疫组织化学分析和蛋白质免疫印迹实验探索阿魏酸抗大鼠肝纤维化机制。结果阿魏酸能够抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径,同时能够抑制核因子(NF)-κB/IκBα途径。结论阿魏酸在CCl_(4)诱导的肝纤维化中能够抑制MAPK和NF-κB/IκBα信号通路,是一种潜在的抗肝纤维化药物。

人突变型IκBα真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人突变型IκBα真核表达质粒。方法:应用RT-PCR及重叠延伸PCR技术,得到点突变的人IκBαM,并定向克隆至PcDNA3.0真核表达载体,酶切和DNA序列测定鉴定。结果:经酶切和DNA序列测定鉴定,证实重组质粒PcDNA3.0-IκBαM构建正确。结论:真核表达质粒PcDNA3.0-IκBαM构建成功,为进一步研究其生物功能打下基础。

核因子-κBp65与IκBα在口腔白斑及鳞癌中的表达

目的:探讨核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)p65及其抑制蛋白IκBα在口腔白斑(OLK)及口腔鳞癌(OSCC)中的表达及其关系。方法:应用免疫组织化学技术检测正常口腔黏膜上皮(n=10)、OLK(n=46)及OSCC(n=36)中的NF-κBp65、IκBα表达。结果:NF-κBp65在正常口腔黏膜、单纯增生型OLK、异常增生型OLK及OSCC的表达率分别为:0%、9.09%、42.86%、72.22%,4组之间差异具有统计学意义(P<0.05);IκBα在4组中呈动态表达,分别为:10%、81.82%、48.57%、86.11%,4组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。NF-κBp65与IκBα的表达在OLK癌变过程中呈负相关(P<0.05),在癌组织中呈正相关(P<0.05)。结论:二者可能是检测OLK的恶变潜能及OSCC早期诊断的敏感指标。

双歧杆菌的完整肽聚糖对实验性大肠癌NFκB和IκBα的影响

目的 :探索分叉双歧杆菌的完整肽聚糖 (WPG)的体内抑瘤途径。方法 :以激光共聚焦显微镜和免疫组化检测了大肠癌裸鼠移植瘤IκBα的含量以及NF κB的活化状况。结果 :大肠癌裸鼠移植瘤经WPG处理后 ,其IκBα的平均荧光强度明显高于肿瘤对照组 (P <0 0 1) ;而NF κB的活化状态则相反 ,WPG注射组大肠癌NF κB的阳性细胞密度显著低于肿瘤对照组 (P <0 0 1)。结论 :分叉双歧杆菌的WPG体内能明显抑制大肠癌IκBα的降解 ,最终阻抑NF κB的活化。

姜黄素对肺纤维化大鼠肺组织NF-κB和IκBα表达的影响

目的观察姜黄素对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织NF-κB和IκBα表达的影响。方法 SD雄性大鼠144只,随机分为假手术组、模型组、醋酸泼尼松组及姜黄素高、中、低剂量组,每组24只。假手术组大鼠气管内一次性滴注等体积的生理盐水,余各组滴注盐酸博莱霉素。造模后第1天开始给药,持续到处死动物的前1天。各组动物于第7天、14天、28天随机处死8只,取肺组织分别采用免疫组化及Western-blot方法结合图像分析来检测各组大鼠肺组织中的NF-κB和IκBα表达水平。结果与假手术组相比,第7天、14天、28天时模型组大鼠肺组织中NF-κBp65的含量均显著升高(P<0.01),而IκBα的含量均显著降低(P<0.01);与模型组相比,醋酸泼尼松组及姜黄素高、中、低剂量均可降低大鼠肺组织中NF-κBp65的含量,而升高IκBα的含量,其中7 d、14 d时姜黄素中剂量组IκBα的含量升高较为显著(P<0.01),28d时,姜黄素高剂量组IκBα的含量升高最为显著(P<0.01)。结论一定剂量姜黄素能促进肺组织中IκBα的表达,而抑制NF-κB的活化和表达。

Ad5F35嵌合腺病毒载体介导的突变性IκBα对白血病细胞凋亡的诱导作用

多种不同类型的白血病均存在持续活化的核转录因子κB(NF-κB),而抑制NF-κB活化诱导细胞凋亡有可能成为治疗白血病新的方法。本研究探讨修饰的5型腺病毒载体即Ad5F35嵌合腺病毒载体(Ad5F35 Vec)介导的突变性IκBα(IκBαDN)对白血病细胞凋亡的作用。将携带缺失5'端1-70个氨基酸编码序列的人IκBαAd5F35-IκBαDN Vec转染HL-60细胞。采用流式细胞术、DNA结合试验、实时定量PCR和Western blot技术分别检测细胞凋亡、NF-κB DNA结合活性、IκBα,cIAP-2和xIAP的表达。结果显示,转染48小时后,转染Ad5F35-IκBαDN Vec细胞、空白载体Ad5F35-EGFP Vec细胞以及未转染细胞的凋亡率分别为(22.53±2.999)%,(6.08±2.464)%和(4.86±1.366)%,其差异具有显著意义(Ad5F35-IκBαDN Vec vs未转染:p<0.001;Ad5F35-IκBαDNVec vs Ad5F35-EGFP Vec:p<0.001,p<0.002)。同时,NF-κB DNA结合活性降低,IκBα表达增加,但cIAP-2和xIAP mRNA的表达降低。结论:Ad5F35 Vec能够有效介导IκBαDN cDNA在HL-60细胞的表达,IκBαDN可抑制HL-60细胞NF-κB DNA结合活性并诱导其凋亡。

妊娠滋养细胞疾病中NF-κBp65和IκBα的表达及临床意义

目的:分析核转录因子κB p65(NF-κBp65)和核转录因子κB抑制蛋白α(IκBα)在正常早孕绒毛及妊娠滋养细胞疾病中表达的差异性,以及与妊娠滋养细胞肿瘤(GTN)(包括侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌)患者年龄及临床分期的关系。并探讨两者在妊娠滋养细胞肿瘤组织中的相关性。方法:采用免疫组化方法(SP法)检测20例正常早孕绒毛组织、30例葡萄胎组织、13例侵蚀性葡萄胎和15例绒毛膜癌中NF-κBp65和IκBα的表达情况。结果:NF-κBp65在正常早孕绒毛组与侵蚀性葡萄胎组、正常早孕绒毛组与绒毛膜癌组、葡萄胎组与侵蚀性葡萄胎组、葡萄胎组与绒毛膜癌组之间阳性表达率比较差异均具有统计学意义(P=0.013,0.018,P=0.026,0.035,P<0.05);IκBα在正常早孕绒毛组与侵蚀性葡萄胎组、正常早孕绒毛组与绒毛膜癌组、葡萄胎组与侵蚀性葡萄胎组、葡萄胎组与绒毛膜癌组之间阳性表达率比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。NF-κBp65和IκBα在GTN中的表达与临床分期有关(P=0.043,0.042,P<0.05),与患者年龄无关。NF-κBp65与IκBα在GTN中呈负相关(r=-0.403,P=0.034,P<0.05)。结论:NF-κBp65上调、IκBα的下降或缺失可能与滋养细胞肿瘤的发生发展以及侵袭、转移有关,NF-κBp65、IκBα两者在妊娠滋养细胞肿瘤组织中的表达呈负相关。