基于ITS 2对家蚕人工饲料霉变病原微生物的检测

【目的】探明引起家蚕人工饲料霉变的病原微生物,为制定防止家蚕人工饲料霉变决策提供科学依据。【方法】对饲料霉变区域随机取样,对其ITS2区域进行序列扩增检测,通过OTU聚类、物种注释和Alpha多样性分析其在不同分类水平下的物种组成。【结果】引起家蚕人工饲料霉变致病微生物主要生物学分类为真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota,99.98%~100%)、散囊菌纲(Eurotiomycetes,99.80%~99.97%)、散囊菌目(Eurotiomycetes,99.80%~99.97%)、毛刷囊菌科(Trichocomaceae,99.80%~99.97%)、石座菌属(Petromyces,99.80%~99.96%)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus,99.75%~99.91%)。【结论】引起家蚕人工饲料霉变的病原菌主要为真菌界的黄曲霉菌。

基于ITS2序列及其二级结构对矩镰荚苜蓿和近缘种的分子鉴定

为准确鉴定矩镰荚苜蓿(Medicagoarchiducis-nicolai)及其近缘种花苜蓿(M.ruthenica)、阔荚苜蓿(M.platycarpos)和毛荚苜蓿(M.edgeworthii),利用DNA条形码技术对4个物种的ITS2序列进行注释、比对、检验,计算种内种间遗传距离,邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树,通过RNAfoldwebserver预测4个近缘种的ITS2二级结构。结果显示,矩镰荚苜蓿及其近缘种的ITS2序列长度为220~221 bp,稳定性好;种间遗传距离(0.004 55~0.022 73)明显大于种内遗传距离(均为0),存在明显的“BarcodingGap”区域;NJ系统发育树显示,毛荚苜蓿聚为一支,矩镰荚苜蓿、花苜蓿和阔荚苜蓿聚为另一支,然后矩镰荚苜蓿与阔荚苜蓿又各自形成单系;在二级结构中,矩镰荚苜蓿与阔荚苜蓿、毛荚苜蓿存在明显差异,但与花苜蓿极为相似,难以区分。分析表明:除花苜蓿外,以ITS2序列作为条形码并辅以二级结构,可以达到对矩镰荚苜蓿、阔荚苜蓿和毛荚苜蓿准确、快速鉴定的目的。

基于DNA条形码ITS1、ITS2及其二级结构对药材巴戟天及易混伪品进行鉴定

[目的]利用DNA条形码ITS1、ITS2碱基序列及其二级结构对巴戟天药材及其混伪品进行鉴定.[方法]利用Codon Code Aligner 17.0或SeqMan软件对测序获得的双向序列进行拼接,从GenBnak上下载巴戟天及其混伪品的ITS1、ITS2碱基序列并利用MEGA 11.0软件分别与测序获得的碱基序列进行比对分析,获得测序样品的ITS1、ITS2碱基序列.将所有ITS1、ITS2碱基序列利用MEGA 11.0软件比对分析,分别构建NJ、ML系统聚类树并计算种内、种间遗传距离及各物种种间碱基变异位点、简约信息位点,利用在线网页构建各物种ITS1、ITS2碱基序列二级结构.[结果]基于ITS1碱基序列巴戟天与大果巴戟、虎刺、鸡眼藤、假巴戟、南五味子、香巴戟、羊角藤的种间遗传距离分别为0.034、0.233、0.052、0.052、1.004、1.004、0.049,种间简约信息位点分别为6、30、9、9、90、90、10个,根据NJ系统聚类树显示虎刺与羊角藤、香巴戟与南五味子无法鉴别,ML系统聚类树显示香巴戟与南五味子无法鉴别.基于ITS2碱基序列巴戟天与大果巴戟、虎刺、鸡眼藤、假巴戟、南五味子、香巴戟、羊角藤的种间遗传距离分别为0.014、0.113、0.034、0.015、0.509、0.516、0.017,种间简约信息位点分别为7、34、15、8、91、88、9个,根据NJ系统聚类树显示除香巴戟与南五味子无法鉴别外,其他各物种均独立聚为一支,ML系统聚类树显示各物种均独立聚为一支.基于ITS2构建的二级结构能够准确对各物种进行鉴别.[结论]基于ITS2构建的ML系统发育树、二级结构均能够对巴戟天及其混伪品进行鉴别,ITS2序列的物种鉴定能力优于ITS1序列.

基于ITS2序列鉴定决明子饮片

目的利用DNA条形码技术对决明子及其混伪品进行鉴别,为决明子基原鉴定提供科学依据。方法采用CTAB法提取决明子样品的DNA,进行PCR扩增、电泳并测序;从GenBank上下载其混伪品的序列。基于隐马尔可夫模型注释得到ITS2序列。运用MEGA6.0软件分析序列特征,计算种内、种间遗传距离,构建系统发育树;利用ITS2数据库预测不同基原决明子及其混伪品的二级结构。结果ITS2序列中发现多个稳定的SNP位点,可根据单个或多个SNP位点对不同基原的决明子及其混伪品进行鉴别。不同基原的决明子具有不同的ITS2二级结构,并在系统发育树中分别聚为一支,具有良好的单系性,可以较为直观地将不同基原的决明子及其混伪品进行区分。经鉴别市售决明子饮片中5份为小决明,其余为钝叶决明,未发现混伪品。结论ITS2序列可以有效鉴别不同基原的决明子及其常见的混伪品。

Phylogenetic, phylogeographic and divergence time analysis of Anopheles subpictus species complex using ITS2 and COI sequences

Objective:To address the phylogenetic and phylogeographic relationship between different lineages of Anopheles(An.)subpictus species complex in most parts of the Asian continent by maximum utilization of Internal Transcriber Spacer 2(ITS2)and cytochrome C oxidase I(COI)sequences deposited at the GenBank.Methods:Seventy-five ITS2,210 COI and 26 concatenated sequences available in the NCBI database were used.Phylogenetic analysis was performed using Bayesian likelihood trees,whereas median-joining haplotype networks and time-scale divergence trees were generated for phylogeographic analysis.Genetic diversity indices and genetic differentiation were also calculated.Results:Two genetically divergent molecular forms of An.subpictus species complex corresponding to sibling species A and B are established.Species A evolved around 37-82 million years ago in Sri Lanka,India,and the Netherlands,and species B evolved around 22-79 million years ago in Sri Lanka,India,and Myanmar.Vietnam,Thailand,and Cambodia have two molecular forms:one is phylogenetically similar to species B.Other forms differ from species A and B and evolved recently in the above mentioned countries,Indonesia and the Philippines.Genetic subdivision among Sri Lanka,India,and the Netherlands is almost absent.A substantial genetic differentiation was obtained for some populations due to isolation by large geographical distances.Genetic diversity indices reveal the presence of a long-established stable mosquito population,at mutation-drift equilibrium,regardless of population fluctuations.Conclusions:An.subpictus species complex consists of more than two genetically divergent molecular forms.Species A is highly divergent from the rest.Sri Lanka and India contain only species A and B.

基于ITS2基因对海南岛热带环境白纹伊蚊的分子鉴定

目的通过对海南岛白纹伊蚊ITS2基因的分子鉴定,分析岛内白纹伊蚊的遗传多样性、单倍型特征及系统发育关系,以揭示海南岛白纹伊蚊种群的遗传结构。方法采集海南岛18个行政市(县)白纹伊蚊,提取基因组DNA并扩增ITS2基因。使用MEGA 11.0软件分析碱基组成,计算遗传距离,并构建系统发育关系。使用DnaSP 6软件和PopArt 1.7软件计算单倍型数量,绘制单倍型拓扑网络图,并分析单倍型多样性。结果获得海南岛18个市(县)白纹伊蚊共计360条ITS2基因,序列长度为536~586 bp,GC含量为51.29%~55.31%,平均种内遗传距离为0.0154,共存在251个单倍型,单倍型多样性指标为0.9870,具有丰富的遗传多样性和错综复杂的亲缘关系。海南岛白蚊伊蚊与洪都拉斯白纹伊蚊的系统发育关系最近。结论海南岛白纹伊蚊种群内部存在广泛的基因交流和丰富的遗传多样性,为种群的进化和适应提供了充足的基因资源。

基于DNA条形码及ITS2二级结构鉴定白头翁及其易混伪品

目的:基于DNA条形码及ITS2二级结构鉴定白头翁及其易混伪品(秋牡丹、火绒草、委陵菜),从而提高白头翁材鉴定的准确性和效率。方法:提取白头翁及易混伪品植物(秋牡丹、火绒草、委陵菜)的DNA,进行PCR扩增并测序,设计特异性引物,并采用特定的分子标记,提取DNA条形码和ITS2(内转录间隔区2)区域的二级结构,使用MEGA11.0软件对白头翁及易混伪品植物进行分析研究。结果:Neighbor-Joining(NJ)树显示白头翁、秋牡丹、火绒草、委陵菜分别独立聚为一支,且白头翁、秋牡丹、火绒草、委陵菜的二级结构在整体骨架上有明显不同,因此根据ITS2碱基序列能够对白头翁及其混伪品进行鉴定。结论:利用DNA条形码及ITS2二级结构能够准确对白头翁及易混伪品(秋牡丹、火绒草、委陵菜)进行鉴定。

泉州“过饥草”类植物的种类调查与ITS2序列分析

目的 采集与鉴定泉州民间一类保胃药用植物“过饥草”(闽南语KèKi Chháu),并选用内转录间隔区2(Internal Transcribed Spacer 2,ITS2)序列作为条形码进行分析。方法 采集泉州区域内“过饥草”类植物样本,经传统形态学鉴定后,提取基因组DNA,测序各样本的ITS和ITS2区域。根据ITS2序列计算各样本间的遗传距离,构建邻接法系统进化树,并预测ITS2序列的二级结构,比较各个ITS2序列二级结构的差异。结果 获取了全部样本的ITS2序列,并将14株采集样本分属于8种植物。而基于ITS2序列的系统进化分析、二级结构比对分析与其形态学鉴定结果一致,可明显区分“过饥草”类植物的物种差异。结论 共梳理出8种“过饥草”类药用植物的物种信息,且ITS2序列可作为鉴别该类民间药用植物的有效条形码。

不同花纹文蛤(Meretrix meretrix)的ITS2分析

采用分子生物学方法,进行了江苏和广西两个地区不同花纹文蛤群体的核糖体DNA转录间隔区(ITS2)的序列分析研究。结果表明,广西的文蛤群体和江苏的群体相比较,仅发现江苏群体在333—336bp处发生了缺失,江苏群体内不同花纹文蛤个体间的ITS2也发生了变化。聚类分析结果证实了序列分析结果,广西文蛤群体和江苏文蛤群体间发生了遗传变异,江苏文蛤群体内部也发生了遗传分化。

不同产地川芎种质与藁本、辽藁本的ITS2序列分析

对6省9个不同地区川芎种质、藁本及辽藁本样品的ITS2序列进行分析,并采用NJ法构建分子系统树。结果显示:9个川芎种质、藁本与辽藁本的ITS2序列共有220个保守位点和8个变异位点,其中信息位点4个,单一变异位点4个。藁本、辽藁本与川芎间GC含量相近,变异位点相似,平均K2P遗传距离分别为0.008,0.011,小于川芎种内遗传距离0.013。NJ进化树分析显示,各地川芎种质、藁本、辽藁本间有着极为亲密的亲缘关系。结合前人本草考证的结果,对川芎的起源、川芎种质间的亲缘关系进行了讨论,首次提出辽藁本也可能是非主栽川芎种质野生种源的观点。

板蓝根与南板蓝根及其混淆品的ITS2条形码鉴定

目的:利用ITS2条形码鉴定区分中药板蓝根与南板蓝根及其混淆品蓼蓝和大青。方法:提取4种中药基原植物基因组DNA扩增ITS2序列,隐马尔科夫模型HMMer进行序列注释,Clustal W法进行序列比对,K2P模型计算种内和种间遗传距离,邻接法构建进化树。结果:遗传距离分析显示,4个物种的最大种内遗传距离为0.034,最小种间遗传距离为0.347,最大种内遗传距离大于最小种间遗传距离。同时4个物种可以在进化树上明显区分开来。结论:ITS2序列可以用于板蓝根与南板蓝根及其混淆品蓼蓝和大青的分子鉴定,相较于传统鉴定方法,该方法更加高效与准确。

基于rDNA ITS1和ITS2序列的褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的分子鉴定

本研究测定了褐飞虱Nilaparvata lugens、白背飞虱Sogatella furcifera和灰飞虱Laodelphaxstriatellus的rDNA ITS1和ITS2的序列,以探讨这3种稻飞虱的分子鉴定方法。3种飞虱的ITS1和ITS2侧翼区(18S,5.8S和28S)序列相对稳定,但ITS1和ITS2序列在3种飞虱中变异较大。ITS1在所分析的438个位点中可变位点达294个,ITS2在分析的403个位点中可变位点为177个。根据3种飞虱rDNA的ITS1和ITS2序列设计了特异性引物,应用特异性引物对样品进行了PCR扩增,分析发现3种飞虱ITS1区的特异性引物扩增效果不理想,而ITS2区的特异性引物可以稳定地扩增出明显的目的DNA条带。因此,采用ITS2区的特异性引物可以对3种飞虱进行快速的分子鉴定。

党参药材及其混伪品的ITS/ITS2条形码鉴定研究

为简便有效地鉴定党参药材及其混伪品并验证ITS/ITS2序列作为DNA条形码鉴定药材的稳定性和准确性,本研究选用党参药材及其混伪品作为研究对象,对33份药材样本提取基因组DNA,通过PCR扩增ITS序列,采用比对法、最小距离法对序列鉴定能力进行评估。通过序列比对,分析变异位点信息确定不同的单倍型并计算种内和种间K2P距离。ITS2序列采用基于隐马尔可夫模型的HMMer(Hidden Markov Model)注释方法获得。结果表明,党参药材3个基原物种ITS序列长度为654-655 bp,ITS2序列长度均为239 bp,ITS/ITS2序列种内平均K2P遗传距离均远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离,因此ITS/ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别党参药材及其混伪品,为其鉴定提供新的技术手段。

蛤蜊科3种贝类16S rRNA基因片段及ITS2核苷酸序列分析

利用PCR技术分别扩增连云港及启东沿海蛤蜊科的西施舌(Coelomactra antiquata)、中国蛤蜊(Mactrachinensis)和四角蛤蜊(Mactra veneriformis)3种双壳贝的16S rRNA基因片段和ITS2核苷酸序列,测序后用DNA star软件分析了核苷酸差异。结果显示:三种贝类16S rRNA基因片段长度相同,均为306bp(去除引物),核苷酸存在多态性,共有45个变异位点,54个核苷酸发生了变异,全部为碱基置换。西施舌与中国蛤蜊此片段核苷酸的同源性为88.9%,与四角蛤蜊的同源性为88.6%,中国蛤蜊与四角蛤蜊的同源性为90.6%。三种蛤蜊ITS2序列分别为390 bp(西施舌)4、41 bp(四角蛤蜊)和466 bp(中国蛤蜊),存在长度多态性,ITS2核苷酸差异分析结果显示,西施舌与中国蛤蜊的同源性为70.9%-71.1%,西施舌与四角蛤蜊的为70.5%-71.0%,中国蛤蜊与四角蛤蜊的同源性为88.1%-88.8%。ITS2序列分析结果与16S rRNA基因片段分析结果一致,2种分子分析法均显示中国蛤蜊与四角蛤蜊的亲缘关系近。

基于ITS2序列的黄连及其伪混品的分子鉴定

为建立重要中药材黄连及其伪混品的DNA条形码鉴定方法,采用国际通用的条形码序列ITS2对黄连属3个物种6份样品的ITS2序列进行PCR扩增与测序,同时从GenBank下载黄连及其常见混伪品共8个物种18个样本的序列信息。采用MEGA5.05计算黄连及其伪混品的种内、种间K2P距离,并基于K2P模型构建NJ树。结果显示:ITS2种间遗传距离大于种内遗传距离,黄连属及其伪混品不同种样品分别聚类在一起,能很好地区分开来。故ITS2序列可以作为黄连及其伪混品鉴定用的条形码。

基于ITS2条形码的曼陀罗属药用植物DNA分子鉴定

目的:利用ITS2序列对曼陀罗属药用植物进行分子鉴定。方法:对曼陀罗属及烟草属植物样本的ITS2序列进行PCR扩增和测序。为扩大研究范围,又从Gen Bank中下载了上述两属植物样本的ITS2序列。所有序列经Codon Code Aligner软件拼接,DNAMAN软件比对分析,并采用MEGA 5.10计算相关数据,基于K2P模型构建聚类树(NJ树)。从ITS2网站上获得所测样本及下载序列的ITS2二级结构信息,分析各样本间ITS2序列二级结构的差异。结果:两属样本被聚为三大支。烟草属单聚为一支;木本曼陀罗单聚为一支,与前人研究结果相同:木本曼陀罗Brugmansia可同曼陀罗属Datura分为两属;曼陀罗属的其他物种聚在一支,且各品种种内样本均各为一支,表现出单系性,与其他种可明显区分;且每两支之间的bootstrap支持率均在95%以上。结论:ITS2序列在近缘物种间的系统学研究、品种的鉴定方面具有较大的应用潜力。

基于ITS2序列鉴定川贝母及其混伪品基原植物

本研究对川贝母5种不同基原植物ITS2序列进行PCR扩增和测序;同时扩大研究范围,从GenBank上下载川贝母及其常见混伪品共10个物种13个样本的ITS2序列。用MEGA4.1计算其种间、种内的K-2-P距离,并分析各样本间ITS2序列二级结构的差异,最后利用ITS2序列重构其系统发育树。结果显示川贝母基原植物种内最大K-2-P距离为0.0276,与混伪品的种间最小K-2-P距离为0.0583;川贝母及其混伪品的ITS2二级结构存在明显差异;重构的系统发育树显示川贝母不同基原物种聚为一支,能较好与混伪品区分。研究结果表明ITS2条形码序列能够成功鉴定川贝母及其混伪品的原植物,为川贝母混伪鉴别提供了新工具。

基于ITS2、trnH-psbA条形码的不同产地连翘及其伪品DNA分子鉴定

目的:研究探讨基于ITS2、trnH-psbA条形码的不同产地连翘及其伪品DNA分子鉴定新技术。方法:采用植物DNA条形码候选序列中的ITS2、trnH-psbA作为目标条形码,探讨了其对不同产地连翘、正品连翘与其易混伪品金钟花的鉴别。结果:从聚类树形图可见,连翘与金钟花能够明显地分为两支,不同产地的连翘也表现出了一定的区域相似性。结论:基于ITS2序列、trnH-psbA序列可以作为连翘药材真伪鉴别的一种有效的分子鉴定手段。其中trnH-psbA序列构建的NJ树、UP树不仅能实现连翘真伪鉴别,而且可以用于不同产地连翘区域性的鉴别。

基于ITS2条形码序列鉴定商品沉香基源植物

目的在沉香性状、显微和理化鉴别、浸出物含量测定的基础上,通过探讨不同品种间的r DNA TIS2序列差异及系统发育分析,为商品沉香的鉴定提供分子生物学依据。方法以白木香、商品沉香及人工诱导沉香为材料,对其进行醇溶性浸出物测定、性状及显微鉴别,提取总DNA、扩增r DNA ITS2片段并直接测定序列,MEGA5.0软件计算种内种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离并进行系统发育分析,构建邻接树（NJ）和最大简约树（MP）。结果人工沉香、商品沉香醇溶性浸出物含量均高于10%,性状和显微鉴别均符合《中国药典》（2010年版）一部有关规定。沉香种内平均K2P遗传距离为0-0.003,种间平均K2P遗传距离为0.005-0.023。白木香、人工沉香和商品沉香在系统发育树上聚为一支。结论在沉香性状、显微和理化鉴别、浸出物含量分析的基础上,基于ITS2条形码序列可以准确鉴别沉香基源植物,为商品沉香的鉴定提供分子生物学依据。

DNA条形码(ITS2)在葫芦科鉴定中应用价值的评估

探讨在纳入分析数据时,数据信息的选择对ITS2序列作为DNA条形码在葫芦科植物中鉴定能力的影响。首先,建立由葫芦科植物ITS2序列组成的3个资料组,其中Dataset1为实验样本,Dataset2由实验样本及Gen-Bank数据库样本组合,Dataset3为从Dataset2中去除部分序列后所得。通过比较3个资料组的种间、种内的变异、Barcoding Gap及鉴定成功率,评估纳入分析的数据选择差异对ITS2鉴定能力的影响。结果显示ITS2序列在3个资料组属水平上的鉴定成功率均达到100%;种水平上,用BLAST1法鉴定成功率分别为100%、67.8%、90.6%,Nearest Distance法鉴定成功率分别为100%、52.5%、66.5%。可见纳入分析的数据选择有差异时,会导致鉴定成功率的较大变化。3个资料组中,ITS2分析仅有Dataset2的Barcoding Gap不够显著。因此对于DNA条形码分析中的数据纳入标准,值得进一步研究。