北京再发黑热病利什曼原虫K26基因和ITS-1序列的多态性分析

目的了解北京市再发黑热病病例的病原分子遗传背景。方法使用PCR方法分别扩增其亲水性酰化表面蛋白B(K26)和核糖体DNA内转录间隔区Ⅰ(ITS-1),然后克隆测序,分析其多态性,构建系统发育树以确定患者感染原虫的虫种类型及其遗传关系。结果K26基因扩增出626 bp大小片段,其长度与国内流行株差异明显,其氨基酸序列由14个氨基酸的基序重复排列组成,但个别位置发生氨基酸替代。K26序列的系统进化树分析显示,北京病例虫株与法国和西班牙的婴儿利什曼原虫相近,但与国内新疆、四川、河北等地的婴儿利什曼原虫虫株距离较远;ITS-1序列扩增出314 bp大小的片段,其系统发育分析显示与婴儿利什曼原虫Leishmania infantum属于同一分支。结论该病例感染的为婴儿利什曼原虫L.infantum,且与国内其他流行区的虫株有一定差异。

阳春砂与绿壳砂、海南砂的ITS-1测序鉴别

目的:从分子水平鉴别阳春砂及其伪充品。方法:从阳春砂及其常见伪充品绿壳砂、海南砂中提DNA,以核基因组通用引物ITS-1为引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序法进行测序。结果:样品ITS-1序列长度均为248bp,但绿壳砂有7个碱基与阳春砂不同,海南砂有12个碱基与阳春砂不同。结论:1序列可有效地鉴别阳春砂及其伪充品。

弓形虫ITS-1序列PCR诊断方法的建立

目的本文旨在为弓形虫感染的临床病例检测建立特异性PCR诊断方法。方法本研究以弓形虫ITS-1序列为种特异性遗传标记,采用有限稀释法稀释速殖子DNA,经PCR扩增,检测该方法的敏感性;用同一引物扩增鸡柔嫩艾美耳球虫原虫和弓形虫,检测PCR方法的特异性。人工感染小鼠和家兔,用组织触片法和PCR方法检测感染动物的组织,并检测10头临床疑似病猪的肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肾脏和肝脏等组织,比较两者的敏感性。结果该PCR方法最低可以检测1pg弓形虫速殖子DNA(相当于10个速殖子的DNA);鸡柔嫩艾美耳球虫原虫未扩增出特异条带,仅弓形虫出现特异条带(300bp)。组织触片和PCR方法对人工感染小鼠组织DNA的检出率均为87.5%(7/8),对人工感染家兔的检出率分别为50%(3/6)和66.7%(4/6),对临床疑似弓形虫病猪检测的阳性率均为20%,两种方法的检查结果基本一致。结论本试验结果表明,PCR技术可以作为弓形虫感染动物的诊断与检测方法。

猪食道口线虫ITS-1和ITS-2rDNA的PCR-SSCP分析

以采自我国不同地区猪体的食道口线虫虫株为研究对象,PCR扩增出ITS-1和ITS-2序列片段,然后采用单链构象多态性(SSCP)方法分析PCR产物,对不同地区食道口线虫进行分子鉴定。所有样品经SSCP分析显示两种带型,第一种为有齿食道口线虫带型,另一种为未定种食道口线虫带型。代表性样品的测序结果表明,未定种食道口线虫带型的样品为四棘食道口线虫。本研究在国际上首次报道了中国猪四棘食道口线虫的ITS序列,并建立了区分有齿食道口线虫和四棘食道口线虫的PCR-SSCP方法,从而为食道口线虫的分子生物学的进一步研究奠定了基础。

3个地区西施舌的ITS-1基因片段序列分析

首次检测了西施舌的ITS-1基因序列片段.并利用ITS-1序列作为遗传标记分析了来自3个不同地区(江苏、福建长乐、福建深沪湾)的西施舌的遗传变异情况.地理位置较近的福建长乐和福建深沪湾的西施舌遗传距离较小,江苏和福建(长乐漳港和深沪)西施舌的遗传距离较大.基于ITS-1序列分析,作为品质突出的福建长乐西施舌和其他地区的西施舌相比,并未形成一个区别于其他地区西施舌的一个独特的种.还基于ITS-1序列分析了西施舌在蛤蜊科和双壳贝类中的分子系统进化地位.

四个鲤鱼种群ITS-1序列的遗传变异分析

对我国四个鲤鱼种群的核糖体DNA内转录间隔区ITS-1进行了PCR扩增、测序.序列分析显示,370bp的ITS-1序列中GC含量明显高于AT含量,共检测到34个变异位点,96个样本得到14个单倍型,平均单倍型多样性为0.637±0.055,核苷酸多样性为0.00857±0.00200,遗传多样性表现较低.黑龙江野鲤种群与建鲤种群间遗传距离最远,为0.10129,黑龙江野鲤种群与黄河鲤种群间遗传距离最近,为0.02305.分子方差分析(AMOVA)表明,群体间遗传分化系数Fst为0.05373,几乎所有变异都来自群体内,群体间遗传分化极小.ITS-1序列构建系统进化树显示,四个种群分为南北2支,黑龙江野鲤和黄河鲤种群聚为北方支,建鲤和荷包红鲤种群聚为南方一支.

我国五大湖三角帆蚌群体ITS-1序列变异分析

对我国五大淡水湖:鄱阳湖、洞庭湖、太湖、巢湖、洪泽湖,鄱阳湖内包括进贤、余干、珠湖、都昌、湖口、永修,合计10个群体三角帆蚌78个个体核糖体DNA基因转录间隔子ITS-1进行PCR扩增、序列测定,获得78条长度为430 bp的同源序列.同源基因序列分析显示,五大淡水湖10个群体三角帆蚌78条ITS-1序列片段,G+C的含量都明显高于A+T的含量.鄱阳湖三角帆蚌的核苷酸多态性指数最高,而巢湖的核苷酸多样性指数最低.基于ITS-1序列片段的遗传距离表明,鄱阳湖内六个点群体间遗传距离很小,在0.0071到0.0092之间.五大湖间三角帆蚌群体遗传距离较远,在0.0752到0.1381之间,ITS-1序列片段构建系统树显示,鄱阳湖6个群体聚在了一起为单独一支,并与巢湖群体亲缘关系相近.洞庭湖群体和洪泽湖群体亲缘关系相近,单独为一支.太湖群体从鄱阳湖、巢湖群体分离开来,单独为一支.

上海四膜虫和两株嗜热四膜虫的rRNA基因ITS-1序列及分子系统关系

测定并比较了自接型的上海四膜虫 (Tetrahymenashanghaienisis)和两株接合型的嗜热四膜虫(T thermophilaⅡ和T thermophilaⅥ )的ITS - 1序列 ,以多态喇叭虫 (Stentorpolymorphrus)为外来群 ,利用最大简约法和邻接法构建了它们的系统发育树。分析指出 :三者中 ,T shanghaienisis较早地从祖先种中分化出来 ;自接型可能是一种较接合型原始的生殖方式。

安氏隐孢子虫ITS-1基因PCR检测方法的建立

【目的】建立针对安氏隐孢子虫的PCR快速检测方法,为安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查提供技术支撑。【方法】根据GenBank中安氏隐孢子虫的ITS-1基因序列设计1对特异性引物,建立基于ITS-1基因的PCR方法,并通过特异性试验、敏感性试验、临床检测以及与经典巢式PCR检测方法进行比较等,验证其可行性。【结果】基于ITS-1基因的PCR检测方法能扩增出安氏隐孢子虫的特异条带,而对猪源隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、牛泰勒氏虫、牛巴贝斯虫、伊氏锥虫、食道口线虫的扩增结果均为阴性;将测序结果进行BLAST比对,发现其与GenBank中安氏隐孢子虫的同源性均在99%以上。敏感性最低可检测每克牛粪中5个卵囊;用于检测广西不同地区的1613份牛粪样品时,与经典巢式PCR检测方法相比,发现两者的阳性检出率均为11.72%,且吻合率达100%。【结论】安氏隐孢子虫ITS-1基因PCR检测方法具有快速、敏感、特异的特点,适用于安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查分析。

中国甘薯小象甲的rDNA ITS-1遗传变异及入侵来源研究

甘薯小象甲是国内外重要检疫性害虫,明确中国不同地区甘薯小象甲的遗传多样性可为甘薯小象甲的鉴别检疫提供依据。通过对中国6个地区甘薯小象甲种群rDNAITS-1序列的遗传变异分析探讨了中国6个地区种群的入侵来源。结合世界其他地区已公布35个甘薯小象甲种群序列,经系统发育分析表明,甘薯小象甲起源于印度次大陆,在亚洲地区随甘薯的调运而自东南向西北扩展,构建的系统发育树分为印度地区分支和亚洲东部分2个大的分支,而亚洲东部分支又进一步划分为东南部和东北部2个亚支,中国的甘薯小象甲种群分别位于东北部分支的2个亚分支上,说明中国6个地区甘薯小象甲种群至少通过2个不同地区侵入中国,并在中国定居。

福建缢蛏野生群体与养殖群体的ITS-1和ITS-2分析

采用PCR技术对福建缢蛏的霞浦野生群体(WP)和漳湾养殖群体(CZ)进行了ITS-1和ITS-2的多态性分析。利用贝类通用引物扩增了ITS-1和ITS-2序列,PCR产物经纯化、测序、同源序列比对,获得长度分别为495 bp的ITS-1和485 bp的ITS-2核苷酸序列,其中分别包括25 bp和22 bp的插入缺失。ITS-1和ITS-2片段的T、C、A、G四种碱基的平均含量分别为13.6%、30.2%、28.3%、29.7%(ITS-1),16.2%、33.7%、19.5%、30.6%(ITS-2),A+T含量显著低于G+C含量。序列分析显示,野生群体和养殖群体的单倍型多样性指数、多态位点数、平均核苷酸差异数分别为1.0、40、10.54(ITS-1),0.96、27、11.91(ITS-2)和1.0、28、8.23(ITS-1),0.96、28、10.16(ITS-2),揭示出福建两个缢蛏群体的遗传多样性均较为丰富,其变异主要源于碱基的插入和缺失,野生群体的多样性较高于养殖群体,但是遗传组成存在着较高的一致性,群体间没有遗传分化。

基于ITS-1序列的5种兔球虫系统进化分析

利用核糖体DNA内转录间隔区1(ITS-1)序列对兔艾美耳球虫进行系统进化分析,并探讨生物学和形态学特征在兔球虫进化中的意义。单卵囊分离大型、黄、肠、中型及穿孔艾美耳球虫卵囊,接种无球虫兔获得纯种卵囊,CTAB法提取卵囊基因组DNA,PCR扩增ITS-1区后克隆、测序。将测序结果与GenBank发布的兔球虫ITS-1序列进行比对和遗传距离分析,绘制系统进化树。结果显示:大型、黄、肠、中型及穿孔艾美耳球虫河北株ITS-1序列分别长320、330、351、336和341bp。5种兔球虫河北株与GenBank中同种兔球虫ITS-1序列相似性分别为96.9%、97.3%、96.9%、99.1%和99.4%。兔球虫形成单系群,该单系群分为2个姐妹谱,与卵囊残体有无相对应,其它形态学和生物学特征与系统进化无相关性。研究结果表明外残体的有无可作为兔球虫进化分类的特征。

基于rDNA ITS-1序列酿酒酵母的系统分类学研究

为了准确快速地为酵母生产提供优良菌株,采用核糖体DNA ITS-1(Internal transcribed spacer 1)序列分析法,对27株酵母菌(其中24株为酿酒酵母属中的酿酒酵母(S.cerevisiae),其他3株分别为汉逊酵母属中的多形酵母(H.polymorph)、克鲁维酵母属中的乳清酵母(K.marxianus)和红酵母属中的粘质酵母(R.mucilaginosa))进行了系统分类学研究,提取这27株酵母菌的基因组DNA并进行PCR扩增,采用琼脂糖和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,能将酵母菌株鉴定到属的水平;对PCR扩增序列进行克隆和测序,结果表明大多数酿酒酵母菌株之间的ITS-1序列有差异,主要表现在序列中的一段Ploy-T上,最少的有7个T,最多的有13个T。研究还用Phylip 3.6等DNA序列分析软件对不同ITS-1序列的菌株进行了系统发育分析,确定出不同菌株之间的亲缘关系,并纠正了长期认为是酿酒酵母的两株酵母菌。

基于ITS-1基因的菜粉蝶地理种群遗传分化研究

为了探讨我国不同地区菜粉蝶种群之间的遗传分化情况,本研究运用克隆测序法,对我国16个地区79只菜粉蝶Pieris rapaerDNA的ITS-1基因序列进行测定并分析;同时,以东方菜粉蝶Pieris canidia为外群,重建了它们的系统发生树,初步探讨了它们的生物地理学分化格局。序列分析结果显示:所测菜粉蝶的ITS-1序列长度介于337～458bp之间。经序列比对后,在347个位点中共有281个保守位点,63个变异位点,16个简约信息位点和47个单突变位点;AMOVA软件分析其核苷酸多态性指数(nucleotide diversity)Pi为0.014,每位点Theta(per site)Eta为0.041,遗传分化指数(FST)为0.351(P<0.05);DnaSP软件共检测出48个单倍型(haplotype)序列,单倍型多样性(haplotype diversity)的频率为0.989。系统发生分析结果表明:现存的菜粉蝶各地理种群与其地理分布没有直接的对应关系根据系统发生树结果推测,该蝶种在我国的最早建群可能发生于辽宁、内蒙古及北京一带,其后,通过幼虫寄主植物的水陆运输以及成虫的迁飞向我国的不同地区扩散。

帘蛤科两种经济贝类种群的ITS-1序列遗传多样性分析

利用核糖体DNA转录间隔区ITS-1序列对硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)的养殖群体和青蛤(Cyclinasinensis)的野生种群遗传多样性进行了分析.经过PCR扩增、连接与测序后,得到硬壳蛤ITS-1的长度为718～724 bp,青蛤的为665～683 bp,序列用ClustalX1.83多重比对后,在725 bp组成的同源片段中有714个碱基序列为保守位点,通过DNAsp软件分析,该种群的核酸多态性指数Pi为0.00302,每位点Eta为0.00304,并检测出4个单倍型(Haplotype)序列.青蛤在由695 bp组成的同源片段中有644个碱基序列为保守位点,该种群的Pi为0.03071,每位点Eta为0.0378,共测出6个单倍型(Haplotype)序列.利用PAUP4.10软件计算出每个种群内单倍型序列间的相对遗传距离,其中,硬壳蛤的遗传距离仅为0.0014～0.0056,说明其DNA遗传多样性的丰度较低;而野生青蛤种群的遗传距离为0.0036～0.0105,说明其遗传多样性比较丰富.文章还初步讨论了双壳类遗传多样性变动的因素及种质保护等问题.

金鱼核糖体转录间隔区(ITS-1)的克隆和序列分析

对金鱼（Carassius auratus）核糖体转录间隔区（ITS-1）进行了克隆测序，并对ITS-1序列进行了分析。结果显示，克隆的金鱼ITS-1区序列长度为294bp，其中A、T、G、C4种碱基的含量分别为17．0％、14．6％、33．0％、35．4％；与从GenBank中检索到的12种鱼的核糖体DNA序列比较显示，其与12种鱼的ITS-1序列同源性较低，在26．0％～61．6％之间；根据金鱼与其他12种鱼的ITS-1序列的同源性构建进化树，所得的分类结果与传统的分类结果基本一致。

黑龙江野鲤核糖体内转录间隔区1(ITS-1)的克隆及二级结构的预测与分析

黑龙江野鲤是中国北方重要的养殖鱼类,分析和了解其遗传结构对鲤鱼种质资源的保护和遗传性状的改良具有重要的意义。该研究对黑龙江野鲤(Cyprinus carpio haematopterus)核糖体内转录间隔区1(ITS-1)进行了克隆测序,并对ITS-1序列进行了分析。结果显示:所克隆的黑龙江野鲤ITS-1序列长度为365 bp,其中A、T、G、C 4种碱基的含量分别为21.4%、12.3%、34.0%和32.3%;与从GenBank中检索到的6种鲤科鱼类的ITS-1序列相比较,相似性较低,介于24.9%至59.5%之间;同时利用最小自由能原理预测7种鲤科鱼类ITS-1序列的二级结构,并分析了其结构特点。根据鲤鱼与其他6种鲤科鱼类的ITS-1序列的同源性构建NJ系统进化树,与根据该保守序列形成的发夹结构的相似性构建的进化树大致相同,所得的分类结果与传统的分类结果基本一致。因此,一、二级结构相结合将是研究物种分子系统学的重要手段。

10株巨型艾美球虫rDNA-ITS-1部分序列测定与分析

用一对种特异性引物,对国内10株巨型艾美球虫ITS-1区进行PCR扩增,对扩增产物纯化、测序与分析,并用DNAStar软件对所检测的10株巨型艾美球虫与GenBank中的所有巨型艾美球虫的ITS-1相应序列进行系统发生进化关系分析。结果显示,扬州株、龙岩株和福州株的ITS-1部分序列片段长度为152bp,其余各株均为151bp。10株巨型艾美球虫的同源性为90.7%～100%,在构建的系统发生进化树中分成2大系群,凤阳株形成一个单系群,其余9株为另一系群。虫株间的亲缘关系与地理位置不尽一致,与免疫交叉保护力无相关性。

基于ITS-1基因序列探讨许氏帆蚌和三角帆蚌的分类地位

测定并比较了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)和许氏帆蚌(Hyriopsis schlegerii)的ITS-1序列,以背瘤丽蚌(Lamprotula leai)为外类群,利用PHYLIP3.65软件中的最大简约法和邻接法构建了它们的系统发育树。结果表明,许氏帆蚌和三角帆蚌没有表现出种间差异,应属于同一物种。

肠艾美尔球虫单卵囊分离及ITS-1序列测定

[目的]建立一种有效的鉴定球虫种类分子生物学方法。[方法]采用单卵囊分离技术,分离肠艾美尔球虫,提取卵囊基因组DNA。根据GenBank中发表的艾美尔属球虫18SrDNA和5.8SrDNA序列,设计特异性引物,扩增内转录间隔区1(ITS-1),PCR产物直接测序。[结果]成功分离出肠艾美尔球虫,PCR扩增出434bp清晰条带,且最低能检测出27个孢子化卵囊。[结论]该研究结果为球虫虫种及虫株的准确鉴定奠定了基础。