番杏LIM基因家族鉴定及TtWLIM1b的克隆与功能分析

【目的】分析番杏[Tetragonia tetragonoides(Pall.) Kuntze]中TtLIM基因家族的序列组成、RNA-seq基因表达和异源表达生物学功能,探究其可能参与调控番杏植株发育和胁迫应答反应的分子机理,为发掘番杏抗逆功能基因及其在作物育种中的应用提供理论基础。【方法】通过前期对番杏[Tetragonia tetragonoides(Pall.) Kuntze]cDNA文库的筛选,获得一个编码番杏LIM基因的全长cDNA,命名为TtWLIM1b,对TtWLIM1b在酵母中进行功能分析。结合番杏全基因组测序信息,从番杏基因组中鉴定出16个TtLIM基因,对这些家族成员的染色体定位、所编码蛋白的理化性质、系统进化以及蛋白的保守模式进行综合的生物信息学分析;构建番杏与拟南芥、水稻和紫花苜蓿的LIM蛋白家族成员的进化树。最后,通过RNA-seq分析TtLIM基因家族成员在番杏不同组织以及在不同胁迫处理后的相对表达量。【结果】异源表达TtWLIM1b能够提高转基因酵母的重金属耐受性及耐热能力;番杏TtLIM家族蛋白成员均含有LIM结构域,而该结构域富含半胱氨酸。因此,TtLIMs也是富含半胱氨酸蛋白(Cysteine rich protein, CRP)的一种。序列分析表明,番杏LIM蛋白成员具有高度的保守性,且其成员的复制扩增较为明显;TtLIM基因家族成员在不同的番杏器官中广泛而有差异地表达。【结论】番杏TtLIMs可能参与调控番杏植株发育和胁迫应答反应。

棉花LIM结构域基因(GhLIM1)的克隆和表达分析

LIM结构域蛋白是一个重要的发育调控因子 ,参与基因转录、细胞骨架建成和信号传导等许多发育调控过程。胞质骨架是形成和稳定细胞形态以及传递物质、能量和信息的重要成分。为研究棉花纤维细胞发育过程中胞质骨架的形成和作用机理 ,通过棉花纤维EST序列整合 ,从陆地棉徐州 14 2胚珠 (含纤维 )中扩增并克隆出棉花LIM结构域基因的编码区段。该棉花LIM结构域基因 (GhLIM1)长 84 8bp ,包含一个 5 70bp的开放阅读框 ,推导的氨基酸序列 (189个氨基酸 )与拟南芥、烟草和向日葵的LIM结构域蛋白有极高的同源性 ,而且两个LIM结构域完整。每个LIM结构域具有植物LIM结构域共有的双锌指结构C X2 C X17～ 19 H X2 C X2 C X2 C X16～ 2 4 C X2 H。RT PCR和Northern杂交分析表明 ,该基因 (GhLIM1)在陆地棉的根、茎尖、下胚轴、叶片、花蕾、花药、胚珠和不同发育时期的陆地棉纤维 (4DPA、12DPA、18DPA)以及海岛棉纤维 (18DPA)和中棉纤维 (12DPA)中均有表达 ,但GhLIM1基因在茎尖、纤维和有纤维的胚珠中表达量更高 ,因此GhLIM1基因应与棉花纤维发育有密切关系。

青岛文昌鱼LIM类同源框基因反义寡核苷酸对其胚胎发育的影响

研究了青岛文昌鱼LIM类同源框基因Bblim反义寡核苷酸对文昌鱼胚胎发育的影响。根据已克隆的Bblim基因序列 ,设计并合成了对应于该基因同源框区的两条反义寡核苷酸链 ,用电脉冲方法将其导入文昌鱼受精卵。结果表明 :反义寡核苷酸与随机序列寡核苷酸都不影响胚胎细胞分裂 ,而反义寡核苷酸能抑制胚胎细胞Bblim基因的表达。还发现只存在于导入反义寡核苷酸的幼体中的两种畸形———一是在幼体的腹侧近咽部有一圆形突起的结构 ;另一是在幼体色素与尾鳍之间约二分之一处的腹侧有一距状突起。这两种畸形均发生于文昌鱼幼体腹侧的近体表部位 。

巴西橡胶树LIM结构域基因克隆与生物信息学分析

根据乙烯利刺激巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳差异表达cDNA文库的EST序列信息,利用RACE技术从胶乳中成功克隆了1个含有LIM结构域的未知功能新基因HbLIM的全长cDNA。生物信息学分析表明,该基因全长cDNA由1016bp的碱基组成,拥有1个570bp的开放阅读框编码189个氨基酸残基;推测氨基酸序列富含Lys,Ser,Ala和Leu,含有2个LIM结构域和2个N-豆蔻酰化位置。序列相似性分析表明,HbLIM编码的氨基酸序列与蓖麻、杨毛、葡萄相应的LIM基因的相似性高达98%,95%和92%。这些研究结果为深入探讨LIM结构域蛋白在巴西橡胶树乳管发育及乳管代谢中的功能奠定了基础。

LIM同源框基因家族与神经系统

同源框基因是指一类含有同源序列的基因，它编码的蛋白质作为转录调节因子调节细胞的发育和分化，控制基因的表达形式。ＬＩＭ同源框基因不仅含有同源框基因也含有编码ＬＩＭ结构域的保守序列。现已发现的属该家族的基因ｌｉｎ－１１、ｍｅｃ－３、ａｐｔｅｒｏｕｓ（ａｐ）、ｉｓｌ－１、ＬＨ－２、Ｒｌｉｍ、ｌｉｍ－１、ｌｍｘ－１、Ｘｌｉｍ－１和Ｘｌｉｍ－３基因等，并且还将会有新的发现。迄今的研究结果表明，ＬＩＭ同源框基因家族的表达产物主要在生物的分化和发育中起调节作用。

LIM同源盒基因家族在神经系统中的作用

LIM同源盒基因家族是同源盒基因的亚家族之一 ,它作为一类转录调节因子 ,通过其LIM结构域特异的分子内或分子间相互作用 ,在不同种类动物的神经系统发育中发挥了极为重要的调控作用。目前发现 ,该家族中的某些基因在成年动物及神经损伤再生过程中也可能有作用。随着对LIM同源盒基因家族研究的不断深入 。

小立碗藓冷驯化相关基因Pp-LIM only A的克隆与表达

植物经历冷驯化后抗冻能力会有所提高。利用cDNA-AFLP方法从经过0oC冷驯化处理的小立碗藓中筛选到差异表达的Pp-LIM only A基因片段。cDNA和基因序列比较分析表明此基因含有7个内含子和8个外显子,编码由345个氨基酸残基组成的蛋白质,其中只含有一个LIM结构域,与动物蛋白质PDZ/LIM家族有很高的同源性,推测是一种新的植物LIM蛋白。实时定量PCR分析显示其在冷驯化6 h后表达量即开始明显增加,并随着冷驯化时间的延长表达量大幅度提高。Pp-LIM only A蛋白可能通过LIM结构域对细胞骨架的作用而影响了细胞膜的稳定性,本研究对其在抗冻中的作用作了进一步讨论。

LIM矿化蛋白-1对间充质干细胞成骨分化影响的实验研究

目的:构建LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)的真核表达质粒,并在兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)内表达,研究LMP-1对体外培养BMSCs成骨分化的影响。方法:RT-PCR克隆hLMP-1和骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2),并构建pIRES2-EGFP-LMP-1及pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒。分离培养BMSCs,脂质体介导下将pIRES2-EGFP-LMP-1、pIRES2-EGFP-BMP-2和pIRES2-EGFP质粒转染BMSCs。7 d后收集细胞,RT-PCR比较hLMP-1、hBMP-2及Ⅰ型胶原的表达,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,免疫组化染色比较骨钙素表达。结果:pIRES2-EGFP-LMP-1和pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒构建成功。重组质粒成功转染BMSCs,RT-PCR证实表达目的基因,hLMP-1和hBMP-2转染组可以明显促进细胞分泌ALP的活性,诱导Ⅰ型胶原和骨钙素的表达。结论:LMP-1可以促进BMSCs向成骨细胞分化。

Lims A:一个新的LIM同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析大鼠不同剪切的Lims基因。方法:应用巢式RT-PCR,以SD大鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTMXa-1T质粒,测序鉴定。结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims A,该变异剪切体编码区为1014bp,编码338个氨基酸。结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的大鼠Lims基因剪切子Lims A,为进一步探索Lims基因在增生性玻璃体视网膜病变中的功能奠定基础。

肌肉LIM蛋白增强生肌素对AChRγ启动子的反式激活作用

采用RT PCR技术克隆了大鼠肌肉LIM蛋白 (MLP) 6 40bp的全长cDNA序列 .以此cDNA为探针进行的Northern印迹表明 ,MLP于C2C12细胞在分化的第 3d至第 5d表达 .将MLPcDNA亚克隆至pcDNA3,构建真核表达质粒pcDNA3 MLP ,同时构建AChRγ启动子序列 (96 0bp)调控的荧光素酶报告基因真核表达质粒pGL3 γ .C2C12细胞转染及荧光素酶活性分析表明 ,复合转染pcD NA3 MLP和pGL3 γ的分化肌细胞表达的荧光素酶活性约为对照的 4倍 ;而在 3T3或未分化肌细胞复合转染pcDNA3 MLP和pGL3 γ均未检出报告基因表达 ,说明MLP可促进生肌素对AChRγ亚基基因启动子的反式激活作用 .

Lims E:一个新的LIM同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因。方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定。结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1164bp,编码387个氨基酸。结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Lims基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础。

LIM激酶及其在神经系统中的作用研究进展

LIM激酶(LIMKs)是一类具有丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸双重活性的激酶。该家族的两大成员为LIMK1和LIMK2。虽然它们结构十分相似,但具有不同的表达、细胞亚定位和功能特点。活化的LIMKs主要作用于Rho激酶家族下游通路,通过调节cofilin蛋白活性影响细胞骨架结构。近期发现LIMKs对神经系统功能有重要影响,如LIMK1与中枢神经系统的发育有关,Limk1基因的缺失参与了神经发育障碍的发病。因此,研究LIMKs在神经系统中的功能具有十分重要的生理学意义。本文综述了LIMKs的蛋白质结构、磷酸化调控机制及其在神经系统中的作用,旨在为临床相关疾病的治疗提供新的思路。

芹菜AgLIMS基因的克隆和生物信息学分析及其表达特性

以芹菜(Apium graveolens Linn.)品种‘六合黄心芹’(‘Liuhe Huangxinqin’)和‘津南实芹’(‘Jinnan Shiqin’)为研究对象,分别克隆获得芹菜柠檬烯合酶基因,命名为AgLIMS,其开放阅读框长1800 bp,编码599个氨基酸。结果显示:2个芹菜品种的AgLIMS基因核苷酸序列存在2个位点的差异,其编码的氨基酸序列也存在2个位点的差异;AgLIMS基因编码的氨基酸序列在第50至第586位存在植物萜类合酶(Terpene cyclase plant C1)保守区域,具有典型的类异戊二烯合成酶(Isoprenoid Biosyn C1)超家族结构域。2个芹菜品种的AgLIMS蛋白的理论相对分子质量分别为69120和69190,理论等电点均为pI 5.52。AgLIMS蛋白的氨基酸序列中,亲水性氨基酸比例高于疏水性氨基酸;其二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲构成,但α螺旋、延伸链和β转角的比例在2个芹菜品种间略有差异;其三级结构均含有1个β折叠,但α螺旋数量在2个芹菜品种间略有差异。AgLIMS基因与多种植物LIMS基因编码的氨基酸序列一致性为61.33%;在系统树上,2个芹菜品种与同科种类的进化关系较近,而与其他科木本种类的进化关系较远。qRT-PCR结果显示:AgLIMS基因在2个芹菜品种的叶片、叶柄和根中均能表达,其相对表达量在叶片中最高、在根中最低,且在不同组织间差异显著;该基因在‘六合黄心芹’不同组织中的相对表达量总体上显著高于‘津南实芹’。在高温(38℃)、低温(4℃)、干旱(质量体积分数20%PEG6000)和高盐(0.2 mol·L^-1NaCl)条件下,2个芹菜品种AgLIMS基因的相对表达量呈现不同的变化趋势;总体上看,‘津南实芹’AgLIMS基因的相对表达量均不同程度升高,而品种‘六合黄心芹’AgLIMS基因的相对表达量则在高温和干旱条件下显著升高。综合分析结果表明:2个芹菜品种的AgLIMS基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列差异很小;AgLIMS蛋白为中性、亲水性蛋白,其进化具有一定的保守性;AgLIMS基因在芹菜中的表达具有组织特异性,且在受到非生物胁迫时其表达特性发生变化,但这种变化效应存在品种间差异。

同源盒基因Lhx3和Lhx4在成年大鼠缺血性脑损伤后的表达变化

目的 揭示发育基因Lhx3和Lhx4参与成年动物中枢神经损伤修复的过程。 方法 线栓法制作局灶性脑缺血模型 ,阻断成年大鼠右侧大脑中动脉 ,缺血 2h后再灌注 ,分别于损伤再灌注后 3d、7d、14d和 2 1d取左右侧大脑皮层组织 ,采用RT PCR结合HPLC测定方法 ,相对定量分析上述不同损伤时相同源盒基因Lhx3和Lhx4在损伤侧与对照侧皮层运动神经元mRNA表达量的改变。 结果 正常成年大鼠大脑皮层运动神经元中 ,Lhx3和Lhx4基因均维持一定的表达水平 ,在局灶性脑缺血再灌注 3d、7d、14d后 ,大脑皮层运动神经元损伤侧的Lhx3和Lhx4基因表达均有明显改变 ,但变化规律不同。其中Lhx3在损伤后mRNA表达量较自身对照侧明显降低 ,而Lhx4的mRNA表达量较自身对照侧明显升高 ,该结果与成年大鼠坐骨神经夹伤后 ,脊髓中Lhx3和Lhx4的基因表达变化规律基本一致。 结论 LIM同源盒基因家族中的Lhx3和Lhx4基因不仅在神经元发育过程中起重要调控作用 ,而且可能参与成年动物中枢神经损伤的修复过程。

神经特异性转录因子DAT1基因的表达

采用生物信息学分析、细胞培养和RT-PCR等方法,以初步解DAT1基因在小鼠主要组织及神经系统相关肿瘤细胞中的表达.生物信息学的基因表达谱分析发现与DAT1同源的EST有100多条,大多数EST分布于胎脑、成年脑、脑肿瘤、肺及肺部的良性肿瘤等组织.SAGE分析发现DAT1在脑及神经系统肿瘤组织中表达非常广泛;RT-PCR方法检测发现DAT1只在脑组织中特异表达,而其它组织如心脏、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、睾丸、卵巢等未见表达;DAT1在培养的正常星形胶质细胞C8中不表达,在胶质瘤、神经母细胞瘤等细胞株中有不同水平的表达.由于DAT1是一种LIM蛋白,而LIM蛋白在细胞的分化、发育调控和肿瘤形成中有重要作用,DAT1在脑及神经系统相关肿瘤中的较高表达提示,DAT1在神经系统中有重要功能,并可能与神经系统肿瘤的发生相关.

同源框基因islet-1表达产物在大鼠脑中分布的免疫组织化学研究

为了解同源框基因ｉｓｌｅｔ－１表达产物（ＩＳＬ－１）在正常成年大鼠中枢神经系统中的形态学分布，采用ＩＳＬ－１特异性抗体的免疫组织化学方法研究了该物质在大鼠脑中的定位分布。结果表明，ＩＳＬ－１广泛分布于除大脑皮层外的神经元细胞核内，尤其在小脑、海马、嗅球等区域其分布更为密集。ＩＳＬ－１在大鼠脑内的分布如此广泛，说明同源框基因ｉｓｌｅｔ－１在正常成年大鼠脑内有着重要的功能。

成年大鼠同源盒基因Lhx4在外周和中枢神经损伤后的修复作用

目的:揭示作为发育基因之一的LIM同源盒基因是否参与调控成年动物神经损伤修复过程。方法利用坐骨神经夹伤的外周神经损伤模型,采用RT-PCR结合HPLC方法,比较分析外周和中枢神经损伤后Lhx4同源盒基因的表达变化规律。结果成年大鼠在外周和中枢神经损伤后Lhx4的mRNA表达量均有改变,坐骨神经夹伤3,7d后,损伤侧脊髓运动神经元中Lhx4mRNA表达量比对照侧明显增高;而脊髓半横断后损伤对侧的大脑皮层运动区中Lhx4mRNA的表达量即刻便发生改变,较对照侧有明显增高,且在脊髓损伤14d时仍可被检测。结论LIM同源盒基因家族中的Lhx4基因可能与成年动物外周和中枢运动神经元的损伤修复有关。

TES基因C端的分段克隆与表达

为了在大肠杆菌中分段表达人类TES基因C端3个顺次排列的LIM结构域,利用PCR技术从含有TES基因全长编码序列的质粒pCMV-HA-TES中扩增出这3个LIM domain基因片段,分别重组入pGEM-T载体,再经酶切后,将获得的目的片段亚克隆入原核表达载体pQE-N1进行融合表达。酶切鉴定及测序结果表明,扩增产物与已知基因序列一致,成功构建了3个目的片段的pQE-N1表达质粒;SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导表达出与预期分子质量大小相同的3个融合蛋白。

LMO2与T细胞白血病

Lmo2基因是LMO(LIM-only)家族的成员之一。作为一个原癌基因,Lmo2的染色体异位t(11;14)(p13;q11)或t(7;11)(q35;p13)与T细胞急性淋巴细胞白血病密切相关。LMO2是细胞中介导转录因子复合物形成的重要接头分子。现对LMO2的分子结构及其在正常和白血病细胞中的调控作用机制的差异作重点介绍。在此基础上还讨论了LMO2成为逆转录病毒介导的基因治疗X染色体连锁的严重联合免疫缺陷综合征过程中成为病毒插入靶位点的可能原因。

与人类原癌基因TTG同源的果蝇ttg基因克隆与分析

人类Ｔ淋巴细胞白血病基因家族（Ｔｃｅｌｌｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｇｅｎｅ，简称ＴＴＧ，或Ｒｈｏｍｂｏｔｉｎ，简称ＲＢＴＮ）是一个肿瘤基因家族，包括有３个基因：ＴＴＧ－１／ＲＢＴＭ－１、ＴＴＧ－２／ＲＢＴＮ－２、ＴＴＧ－３／ＲＢＴＮ－３。其中ＴＴＧ－１和ＴＴＧ－２是分别在二个具有不同染色体易位的Ｔ淋巴细胞白血病人中克隆到的。这个基因家族共同含有一个ＬＩＭ结构，这个ＬＩＭ结构编码一个二次重复出现的富含半胱氨酸的保守区域，而这个结构的功能至今不详。在发现原癌基因ＴＴＧ－２在哺乳动物、果蝇和酵母中高度保守后，为了研究ＬＩＭ结构的功能取得一个模式系统，首先在果蝇基因组文库中克隆到了果蝇与人类ＴＴＧ家族同源的果蝇ｔｔｇ基因，证实在果蝇体内只有一个ｔｔｇ基因（即Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｔｔｇ简称ｄｔｔｇ）。这个基因的ｃＤＮＡ克隆全长２０８７ｂｐ，编码一个２６６个氨基酸的肽链。５＇端有二种不同的剪接方式。并且ｄｔｔｇ蛋白也含有一个二次重复的保守的ＬＩＭ结构。ｄｔｔｇ外显子的结构与人类的ＴＴＧ－１更接近，ＬＩＭＩ是一个外显子，ＬＩＭ２被一个内含子分隔为二个外显子。在氨基酸序列上ｄｔｔｇ与ＴＴＧ－１有７９％的同源性，与ＴＴＧ－２?