shRNA抑制小鼠肝癌细胞株JNK的表达及细胞迁移和侵袭

目的:研究shRNA对小鼠肝癌细胞株Hca-F JNK基因表达的抑制作用及对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,阐明JNK表达水平与小鼠肝癌细胞淋巴转移潜能的关系。方法:构建3条shRNA表达载体,以脂质体法稳定转染Hca-F细胞;RT-PCR和Western blotting检测shRNA对JNK基因和蛋白表达的抑制作用,筛选出RNA干扰效果最好的shRNA;Transwell实验检测Hca-F细胞穿膜细胞数观察shRNA对Hca-F细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。结果:成功构建pSilencer-shRNA表达载体并稳定转染Hca-F细胞,筛选出对JNK表达抑制效果最好的shRNA;其转染后JNK mRNA表达水平与其他组比较明显下调(P<0.01);JNK蛋白质表达水平与其他组比较明显减少(P<0.01);转染shRNA后Hca-F细胞穿膜细胞数均显著下降(P<0.05)。结论:通过建立pSilencer-shRNA表达载体并稳定转染Hca-F细胞株,获得JNK表达稳定下调的Hca-F细胞株,抑制JNK表达水平可降低小鼠肝癌细胞的迁移和侵袭能力,JNK可能是决定肝癌淋巴转移潜能的重要基因之一。

超声靶向破坏微泡技术介导小鼠肝癌细胞株JNK1基因表达、细胞迁移和侵袭抑制

目的:探讨应用超声靶向破坏微泡(UTMD)技术介导小鼠肝癌细胞株JNK1基因的表达、细胞迁移和侵袭抑制的作用,阐明其作用机制。方法:构建并筛选RNA干扰效果最好的短发夹RNA(shRNA)。将小鼠肝癌细胞株Hca-F分为正常Hca-F细胞组、shRNA质粒组、脂质体组、超声微泡结合超声辐照组及脂质体结合超声微泡加超声辐照组。采用倒置荧光显微镜观察各组细胞转染率,荧光定量PCR和Western blotting法检测JNK1基因mRNA和蛋白表达水平,CCK-8法检测各组细胞的细胞活性,应用Transwell实验检测各组细胞的体外迁移能力。结果:脂质体结合超声微泡加超声辐照组细胞转染率高于shRNA质粒组、脂质体组和超声微泡结合超声辐照组(均P<0.05),脂质体组和超声微泡结合超声辐照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。脂质体结合超声微泡加超声辐照组JNK1mRNA和蛋白表达水平低于其他各组(P<0.05);脂质体结合超声微泡加超声辐照组细胞活性和平均穿膜细胞数均低于其他各组(P<0.05)。结论:UTMD技术结合脂质体转染法可以提高小鼠肝癌细胞株JNK1shRNA的转染效率,增强其对基因表达、细胞活力、迁移和侵袭能力的抑制。

实验性肝纤维化大鼠血清Ⅲ型前胶原N端肽和脯胺肽酶活力的动态观察

用CCl_4腹腔注射2至11周诱发大鼠肝纤维化,动态观察其血清Ⅲ型前胶原N端肽(sP Ⅲ NP)、脯胺肽酶活力的变化,并以半定量评分估测肝纤维化程度。sP Ⅲ NP 和脯胺肽酶活力在第2周开始增加,第6周达峰值,第9至11周保持较高水平。前6周sPⅢNP和脯胺肽酶均与肝纤维化评分呈正线性相关;在11周内,脯胺肽酶和sPⅢNP 也呈正线性相关。结果表明:sP Ⅱ NP 是反映肝纤维化的主要指标之一;脯胺肽酶活力可能是反映肝内胶原代谢加速的指标。

HBV相关肝细胞癌患者血清N-糖组图谱改变与肝组织糖基转移酶表达变化的关系

目的本研究通过对HBV相关肝细胞癌(HCC)患者血清N-聚糖检测及肝癌组织与癌旁组织中糖基转移酶基因表达水平比较分析,探索HCC患者血清N-聚糖变化的可能机制。方法收集解放军总医院2018年—2019年HBV相关HCC手术患者(34例)的肝癌和癌旁组织及正常肝组织标本,同时采集血清标本。从34例HCC患者中随机选择8例HCC患者血清标本作为HCC试验组,20例健康成年人血清标本作为对照组。应用DSA-FACE法分析HCC试验组与对照组血清N-聚糖图谱。采用荧光定量PCR法检测34例HBV相关HCC患者癌组织和癌旁组织中8种糖基转移酶基因(FUT3、FUT4、FUT6、FUT7、FUT8、Gn-TⅢ、Gn-TⅣa和Gn-TⅤ)mRNA表达水平,并应用蛋白印迹法检测相应蛋白表达水平。计量资料两组间比较采用独立样本t检验。结果与对照相比,8例HCC患者血清中N-聚糖峰9(peak9,NA3Fb)的丰度明显升高(t=-2.514,P<0.05)。糖基转移酶FUT8、Gn-TⅣa和Gn-TⅤ基因mRNA表达水平在癌组织和癌旁组织间有差异,其中癌组织中FUT8和Gn-TⅤ基因的mRNA与蛋白表达水平显著高于癌旁组织(mRNA:1.50±0.34 vs 0.65±0.11,t=-2.354,P=0.022;3.57±0.64 vs 1.33±0.16,t=-3.384,P=0.001)(蛋白:0.70±0.11 vs 0.083±0.017,t=9.555,P=0.001;1.33±0.19 vs 0.60±0.15,t=5.097,P=0.007);癌组织中Gn-TⅣa基因的mRNA表达水平显著高于癌旁组织(mRNA:2.90±0.47 vs 1.68±0.19,t=-2.403,P=0.019),蛋白表达水平与癌旁组织无显著差异(蛋白:0.52±0.24 vs 0.24±0.11,t=1.833,P=0.141)。癌组织中这些糖基转移酶表达改变与血清中N-聚糖丰度变化一致。结论HBV相关HCC患者血清中一些N-聚糖水平变化可能与肝癌组织中糖基转移酶基因GnT-V、GnT-IVa和FUT8表达上调密切相关。

苦参碱对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的预防作用

目的 研究不同剂量苦参碱 (MT)对二乙基亚硝胺 (DEN)诱发大鼠肝癌的预防阻断作用。方法 采用0 0 1%的DEN诱发大鼠肝癌 90d ,同时分别用MT注射液30、15、3mg/kg腹腔注射和 3mg/kg灌胃。停止诱癌及给药处理 30d后 ,处死大鼠 ,观察大鼠肝脏的病理改变、肝表面癌结节数、肝 /体重比和血清中丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、γ 谷氨酰转肽酶 (γ GT)、碱性磷酸酶 (ALP)的变化。结果 3mg/kgMT腹腔注射组和灌胃组的体重明显高于模型组 ,肝表面癌结节数、肝 /体重比和血清ALT、γ GT明显低于模型组和它MT腹腔注射组 (P <0 0 5 ) ;但腹腔注射的三组中ALP较模型组有不同程度升高 ,灌胃组则有所下降。结论 MT用于预防阻断DEN诱发大鼠肝癌时 ,不论剂量大小或给药途径如何 ,均不能完全阻断DEN诱发大鼠肝癌的发生。但小剂量 (3mg/kg)的MT长期口服应用 ,能保护肝细胞免受损伤 。

疏肝汤剂防治大鼠肝纤维化作用的实验研究

采用疏肝软坚汤剂对大鼠肝纤化的防治作用进行了研究 ,从血清学和形态学方面观察了疏肝软坚汤剂对肝纤维化大鼠的影响 ,旨在探讨其抗肝纤维化的作用机制。结果表明 ,疏肝软坚汤剂可有效地防治大鼠肝纤维化 ,显著降低模型大鼠血清PCⅢ、HA、NAG含量 ,与对照组比较差异显著 ,且大剂量组肝脏形态学改变轻微。提示疏肝软坚汤有防治大鼠肝纤维化作用。

奥曲肽与胰岛素对人肝癌细胞影响的实验研究

目的 探讨在体外胰岛素能否促进人肝癌细胞增殖 ,奥曲肽对其诱导的增殖活动有无抑制作用。 方法 将奥曲肽与胰岛素直接作用于体外培养的人原发性肝癌细胞株 ,运用MTT、直接细胞计数及流式细胞仪测定等方法观察奥曲肽与胰岛素对肝癌细胞的活细胞数及其比值、细胞总数、细胞周期及增殖指数 (PI)的影响。 结果 胰岛素 (0～ 5 μg/ml)使人肝癌细胞株BEL 740 2的细胞总数、活细胞数及其比值增加 ;而奥曲肽 (0～ 2 μg/ml)则使细胞基础的及胰岛素刺激的细胞总数、活细胞数及其比值下降。 5 μg/ml的胰岛素增加细胞的PI值而 1μg/ml的奥曲肽降低其PI值 (P <0 0 5 ) ,并产生S期阻滞作用。 结论 在体外 ,胰岛素可诱导人肝癌细胞增殖 ,奥曲肽不仅直接抑制肝癌细胞的增殖 ,对胰岛素诱导的肝癌细胞增殖也有抑制作用。