鸡贫血病病毒套式PCR检测方法的建立及应用

鸡贫血病病毒不仅引起鸡的传染性贫血 ,而且也是引起鸡免疫抑制病的主要病原。本研究首次在国内建立了鸡贫血病病毒的套式PCR检测方法。试验证明此方法具有高度的特异性和敏感性 ,以鸡马立克氏病毒、鸡网状内皮组织增生病毒、鸡传染性法氏囊病毒、正常MDCC_MSB1细胞DNA作为模板扩增时均未出现可见带 ,在检测鸡的各种组织病料时均未出现假阳性结果 ,该法比一次性PCR的敏感性高约 1 0 0 0倍 ,能检测到约一个拷贝的鸡贫血病病毒DNA ,而一次性PCR只能检测到3.6× 1 0 3 个拷贝。此方法已成功地应用于临床试验。对于鸡贫血病毒的许多鸡胚分离物和细胞分离物 ,一次性PCR不能扩增出可见电泳条带 ,而套式PCR都能扩增出特异的DNA片段 ,从而说明 ,套式PCR的敏感性大大高于一次性PCR 。

甘薯丛枝病植原体的PCR检测

以报道的植原体 (Phytoplasma) 1 6SrDNA基因保守序列为依据 ,设计合成了两对引物对R1 6mF2 /R1 6mR2 和R1 6F2 /R1 6R2 ,以甘薯丛枝病 (SPWB)带病植株的叶脉中提取的DNA为模板 ,应用聚合酶链式反应(PCR)技术和巢式PCR(Nested_PCR)技术对甘薯丛枝病病原进行分子检测。结果表明PCR扩增出了 1 .5kb的特异片段 ,在PCR基础上的巢式PCR扩增出了 1 .2kb的特异片段。灵敏度实验显示该方法所需PCR模板DNA量为 0 .1 0 73ng/μl,在PCR基础上的巢式PCR可以将灵敏度提高约 1 0 0 0 0倍 ,所需模板DNA仅为 0 .0 1 0 73pg/μl,在甘薯丛枝病的检测中是一种快速、灵敏、可靠的方法。

广西HIV-1流行毒株膜蛋白基因的扩增与纯化

目的扩增广西HIV_1感染者的HIV_1膜蛋白基因C2_V3 区核酸片段并提纯回收 ,进行核苷酸序列测定与亚型分析。方法用淋巴细胞分离液从HIV_1感染者的静脉血中分离PBMCs,然后用多组不同的内外侧引物进行Nested_PCR扩增HIV_1膜蛋白基因C2_V3 区核酸片段 ,后用琼脂糖电泳进行提纯 ,用荧光标记末端终止物循环测序试剂盒进行测序 ,反应物用自动DNA序列分析仪进行序列测定和分析。结果经琼脂糖凝胶电泳检测 ,获得26份DNA阳性产物 ,阳性率为86.67%。不同引物的阳性率相差较大 ,根据扩增结果可以推断广西HIV_1流行毒株的基因变异程度。14份HIV_1核苷酸序列测定与亚型分析结果 ,9份为B亚型 ,5份为E亚型。结论广西存在E和B亚型HIV_1毒株的流行。

RT-PCR检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的研究

根据猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)和猪呼吸道冠状病毒 (PRCV)的基因组核苷酸序列 ,在S基因 (纤突蛋白基因 ) 5′端保守区设计了一对引物P3 /P4,该对引物在TGEV扩增跨幅约为 2 .4kb ;而PRCV由于在此区域存在一约 0 .6kb碱基缺失 ,扩增跨幅约为 1.8kb。用引物P3 /P4对TGEVMiller株、Purdue株和PRCVAR310株分别进行RT_PCR ,根据RT_PCR扩增片段大小可以直接区分TGEV和PRCV。用引物P3 /P4与引物P1/P2 作Nested_PCR ,提高了该RT_PCR的特异性和敏感性 。