基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑

【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表明CRISPR/Cas9在T1代转基因阳性植株中未重新发挥基因编辑作用。对20株突变体的5个潜在脱靶位点进行分析,5个潜在脱靶位点均未检测出脱靶效应,表明所设计靶序列具有较高特异性。对选取的3组不同基因型ospil15 T1代突变体表型进行初步观察,结果表明,突变体生育期和分蘖数未出现明显变化,株高极显著下降,籽粒粒长极显著增加,最大增幅达5.69%。【结论】CRISPR/Cas9系统能对OsPIL15进行定向编辑,获得的10种不同突变基因型的ospil15突变体与野生型相比株高极显著降低、籽粒粒长极显著增大。

光敏色素互作因子OsPIL15基因对水稻磷、氮吸收利用的影响

为了分析水稻(Oryza sativa)光敏色素互作因子OsPIL15(Phytochrome interacting factors-like 15)基因调节水稻磷、氮吸收的分子机制,首先利用Transcriptome ENcyclopedia of Rice数据库分析OsPIL15基因对低磷的响应,然后以日本晴和Ospil15突变体为材料,用正常磷(300μmol/L NaH_(2)PO_(4))和低磷(10μmol/L NaH_(2)PO_(4))营养液进行培养,测量水稻幼苗根与地上部生物量及磷、氮含量,并计算磷、氮吸收效率、转运系数及利用率。结果表明,OsPIL15基因响应低磷胁迫,低磷胁迫条件下,Ospil15突变体根和地上部长降幅均小于日本晴;Ospil15突变体地上部干质量降低幅度与日本晴基本一致,但根干质量降低幅度小于日本晴。正常磷条件下,Ospil15突变体根中磷含量显著高于日本晴,而地上部中磷含量与日本晴无显著差异;低磷胁迫条件下,Ospil15突变体根和地上部中磷含量均显著高于日本晴。正常磷和低磷胁迫条件下,Ospil15突变体磷吸收效率均大于日本晴;正常磷条件下,Ospil15突变体磷转运系数小于日本晴,低磷胁迫条件下,磷转运系数大于日本晴。Ospil15突变体对水稻氮吸收亦有影响,Ospil15突变体在正常磷条件下地上部中氮含量显著高于日本晴,而根中氮含量无显著差异;低磷胁迫条件下,根中氮含量显著高于日本晴,而地上部中氮含量没有显著差异。Ospil15突变体在正常磷和低磷胁迫条件下氮吸收效率均高于日本晴,低磷胁迫条件下,氮转运系数小于日本晴,Ospil15突变体在正常磷和低磷胁迫条件下磷、氮利用率均高于日本晴。综上,Ospil15突变体提高了水稻磷、氮吸收和利用,在低磷胁迫条件下,Ospil15突变体提高了磷从根向地上部的转运,抑制了氮从根向地上部的转运,表明OsPIL15基因负调控水稻磷、氮吸收利用。