重组人OCIF结构域D1～D6基因在毕赤酵母中的表达

利用PCR以实验室构建的原核重组表达质粒pProEX-OCIF为模板扩增得到N末端融合有6×His标签和rTEV蛋白酶识别序列的人破骨细胞形成抑制因子(OsteoclastogenesisInhibitoryFactor,简称OCIF)结构域D1～D6(简称O CIFm)编码基因片段;将其与pMD18-T连接,转化大肠杆菌TOP10,筛选得到阳性重组质粒pMD18-OCIFm,双酶切重组克隆质粒pMD18-OCIFm得到OCIFm基因片段;将其定向插入甲醇营养型酵母分泌表达载体pPIC9中,构建获得重组表达质粒pPIC9-OCIFm.测序验证后,以限制性内切酶SalⅠ线化,电穿孔转化酵母宿主菌GS115.筛选得到阳性表达菌株后,甲醇诱导表达4d,SDS-PAGE和Westernblot对表达情况进行分析和确认.所获得的OCIFm基因片段在甲醇营养型酵母中表达量占菌体总蛋白的30%以上.利用Ni-NTA树脂对表达产物进行一步亲和层析纯化.活性测定表明纯化的表达产物可诱导体外培养的成熟破骨细胞样细胞的凋亡.表达产物的生物学活性较利用原核表达系统明显提高.

周期性张、压应力作用下人牙周膜干细胞RANKL/OPG的变化

目的:对周期性张、压应力作用下人牙周膜干细胞(h PDLSCs)RANKL、OPG及RANKL/OPG比值的变化进行初步探讨。方法:用3 000μstrain,0.5 Hz的周期性张、压应力对h PDLSCs分别加载0(对照组)、3、6、12、24 h。Western blotting检测RANKL和OPG的变化,计算RANKL/OPG比值的变化。结果:周期性张应力作用3 h,RANKL/OPG比值达到最低点(0.902±0.196),显著低于对照组水平(P=0.000),此后开始上升,但直到24 h,仍低于对照组水平。周期性压应力作用3 h,RANKL/OPG比值达到最高点(1.058±0.147),显著高于对照组水平(P=0.000),6 h(0.996±0.103)回落到对照组水平(P=0.152),此后直到24 h(0.8449±0.041),显著低于对照组水平(P=0.000)。结论:周期性张、压应力都可以上调h PDLSCs的RANKL和OPG表达。在周期性张应力加载的最初24 h,h PDLSCs不能促进破骨细胞分化;而周期性压应力加载的最初6 h,h PDLSCs可以促进破骨细胞分化,此后转而抑制破骨细胞分化。

人破骨细胞生成抑制因子编码区基因的克隆及在成肌细胞中的表达

目的 :克隆人破骨细胞生成抑制因子 (OPG/OCIF)编码区基因并在真核细胞中表达。方法 :以人骨肉瘤细胞系MG63的总RNA为模板 ,采用RT -PCR法得到OPG/OCIF的编码区cDNA ,构建真核表达载体 pIRES2 -OPG -EGFP ,在脂质体介导下转染小鼠成肌细胞系C2C12 ,经G418压力筛选建立稳定转染人OPG/OCIF的细胞系 ,共聚焦荧光显微镜及核酸杂交方法检测OPG/OCIF在细胞中的表达。结果 :获得的人OPG/OCIF编码区全长cDNA序列与文献报道的核苷酸序列一致 ,核酸杂交证实稳定转染人OPG/OCIF编码区cDNA的小鼠成肌细胞系中有OPG/OCIFmRNA的表达。结论 :获得人破骨细胞生成抑制因子编码区全长cDNA并证实在真核细胞中稳定表达。

补肾法对去卵巢大鼠OPG/RANK/RANKL信号通路影响的Meta分析

目的:随着全球老龄化趋势的发展,绝经后骨质疏松症(PMOP)已成为世界性的女性健康问题。目前常用的生物制剂存在不良反应多、无法长期用药等缺陷。多项Meta分析已证明补肾法对PMOP患者的安全性和有效性,但其治疗机制尚不明确。该文Meta分析评估基于PMOP动物模型的补肾法对骨保护素(OPG)/核转录因子(NF)-κB受体激活因子(RANK)/NF-κB受体激活因子配体(RANKL)信号通路的影响,为用补肾法治疗PMOP提供实验依据。方法:计算机检索PubMed,Ovid Medline,Embase,中国知网(CNKI),维普和万方数据库,以收集检索从建库至2020年1月的研究,并对每篇纳入文章的研究质量进行了评估。根据SYRCLE的偏倚风险工具对每一篇纳入的文章的研究质量进行评价。使用RevMan 5.3软件根据Cochrane系统评价方法进行Meta分析。结果:包括619只大鼠的32项研究,纳入研究的质量分数都在3~5分。Meta分析结果表明,补肾法在增加骨密度(BMD)值方面优势明显[标准化均数差(SMD)=2.01,95%置信区间(CI)=1.50~2.52,P<0.000 01]。同时补肾法可增加卵巢切除(OVX)大鼠骨组织中血清OPG水平(SMD=3.33,95%CI=2.59~4.07,P<0.000 01),提高OPG mRNA表达(SMD=11.81,95%CI=7.49~16.13,P<0.000 01)和促OPG蛋白生成(SMD=4.95,95%CI=3.09~6.81,P<0.000 01)。补肾法可以降低血清RANKL水平(SMD=-4.88,95%CI=-6.01~-3.75,P<0.000 01)和RANK水平(SMD=-7.30,95%CI=-9.53~-5.07,P<0.000 01);补肾法还可降低骨RANKL mRNA(SMD=-6.22,95%CI=-8.95~-3.49,P<0.000 01)和骨RANK mRNA(SMD=-3.18,95%CI=-6.19~-0.18,P<0.05)及RANKL蛋白在骨组织中的表达(SMD=-3.99,95%CI=-5.47~-2.50,P<0.000 01)。结论:该研究发现补肾法在调节PMOP的动物模型中OPG/RANK/RANKL信号通路平衡方面具有重要优势,但仍然需要更多的样本,合理的设计和高质量的动物实验来进行进一步的验证。

激素性骨坏死骨质丢失与骨保护蛋白表达的相关研究

目的 探讨在激素性骨坏死的病程中 ,股骨不同部位骨保护蛋白 /破骨细胞形成抑制因子 (OPG/OCIF)的表达情况 ,与局部骨质丢失是否存在着相关性。 方法 31只新西兰白兔复制Yamamoto激素性骨坏死模型 ,内毒素和甲基强地松龙给药结束 3d后存活 2 4只 ;随机选 4只作为对照组 ,其余随机分为 4个不同时间组 ,每组 5只 ;按照不同时间组处死动物 ,进行股骨的骨密度值测量、病理切片H E染色和茜素红染色病理及OPG/OCIF组织化学染色 ,并进行图像处理和统计分析。结果 在激素性骨坏死早期 ,给药后 2周股骨的OPG/OCIF表达明显降低 (P <0 0 1) ,同时局部骨髓内出现了大量的破骨细胞 ;继而出现明显的骨质丢失 (从 0 375± 0 0 37、0 2 97± 0 0 2 2降至 0 173±0 0 2 4、0 183± 0 0 6 1,P <0 .0 5 )。 结论 糖皮质激素可抑制骨骼局部OPG/OCIF的表达 ,从而促进了破骨细胞分化与活性 ,加剧激素性坏死局部的骨质丢失。