杨树脯氨酸合成关键基因PagP5CS1全长克隆及功能验证

杨树是重要的工业用材树种。我国北方干旱和半干旱地区水分匮乏,干旱已成为影响杨树人工林可持续发展的一个重要因素。游离脯氨酸的积累常常在植物应对干旱等渗透胁迫时出现,以缓解干旱胁迫带给植物的损害。P5CS作为编码脯氨酸合成关键酶的基因,对于植物调控游离脯氨酸合成、增强耐干旱能力非常关键。该研究克隆84K杨脯氨酸合成代谢的关键基因PagP5CS1并在银中杨内进行遗传转化,从表型、分子和生理水平上对PagP5CS1转基因杨树株系进行了功能鉴定。本研究构建的PagP5CS1超表达载体通过叶盘法转化至银中杨叶片,成功获得12个PagP5CS1超表达杨树株系,其中P5CS1基因表达量最高的转基因株系为野生型表达量的8.3倍。经过干旱胁迫处理,相对于野生型,超表达株系叶片萎蔫程度更低;在干旱胁迫下,超表达株系中P5CS1基因表达量和脯氨酸含量均高于野生型,说明P5CS1超表达增强了杨树的耐旱性,P5CS1基因在干旱胁迫下发挥了正向调控作用。综上所述,杨树P5CS1基因对干旱胁迫高度响应,PagP5CS1超表达杨树会通过增加脯氨酸积累来增强杨树的耐旱性。

苎麻Δ~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）基因的克隆和表达分析

以耐旱性较强的湘苎3号为材料,从苎麻转录组测序结果中获得了1个与P5CS基因高度相似的Unigene,该片段长1448bp,根据该序列设计5′RACE和3′RACE槽式PCR引物,利用RACE结合RT-PCR技术分别克隆得到590bp的5′端和293bp的3′端,拼接获得该基因全长cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析表明,该基因全长为2318bp,其中开放读码框为2154bp,编码717个氨基酸,其编码蛋白质的等电点和分子量分别为6.57kD和77.56kD,与亚洲棉、麻风树、拟南芥和水稻的P5CS基因的核苷酸序列相似性分别为81%、81%、75%和72%,蛋白质序列的相似性分别为86%、85%、78%和77%,说明该基因与P5CS为同源,被命名为BnP5CS1。半定量RT-PCR分析表明,该基因在苎麻的茎尖中表达量最高,在根中其次,且受干旱胁迫的诱导。P5CS基因是植物体内合成脯氨酸的关键酶基因,BnP5CS1基因的克隆将为苎麻的抗逆分子育种和进一步的功能分析鉴定基础。

p5CS基因在蒙农杂种冰草植株中的表达及耐盐性研究

为尽快培育出适宜我国干旱荒漠地区大面积推广的耐盐冰草新品种,试验以经PCR和Southern blot杂交检测的含有p5CS基因的蒙农杂种冰草植株为材料,用Northern blot检测目的基因在转化植株中的表达;并用1.5%NaCl盐溶液进行胁迫处理确定转化植株的耐盐性。结果表明:转基因冰草植株与DIG标记探针杂交呈现明显的杂交带;盐胁迫下,游离脯氨酸含量增加较快,质膜透性、丙二醛含量增加较小,SOD活性较高。说明p5CS基因能够在冰草基因组的转录水平上表达,表达植株的耐盐性明显增加。

羊草Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(LcP5CS1)基因的克隆与分析

羊草具有耐寒、耐盐和耐旱等特点,是一种兼具经济价值和生态价值的多年生重要牧草。脯氨酸是植物在渗透胁迫下积累的主要渗透调节物质之一。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸的谷氨酸合成途径中的关键酶。根据前期Solexa测序结果的数据,设计同源引物,从羊草中克隆了一个P5CS基因,该基因cDNA序列全长2 197bp,推断其编码730个氨基酸,根据序列比对将其蛋白命名为LcP5CS1。同源性分析表明:LcP5CS1与单子叶植物短柄草P5CS的同源性为95%,而与双子叶植物的P5CS同源性较低。表达模式分析表明,在叶鞘、叶和茎中,LcP5CS1均有较高表达;在冷、ABA、盐和干旱胁迫下,该基因明显受胁迫诱导,并随胁迫时间的延长,其表达量总体呈上调趋势。对羊草人工创伤处理后的Solexa测序差异表达数据分析表明:LcP5CS1在处理2和6h后表达量明显提高,推测羊草创伤处理后体内脯氨酸含量升高可能是其耐牧的一种适应性机制。

植物△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）基因的研究进展

△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物脯氨酸生物合成的关键酶。近年来,许多学者对P5CS酶基因克隆、其在植物中的表达特性与在抗逆基因工程上的应用进行了大量研究,证实P5CS基因已成功在许多植物中进行过量表达并能有效提高植物的抗旱、耐盐性。随着分子生物学和现代生物技术的快速发展,今后可进一步挖掘利用植物P5CS基因,有效验证其功能和了解其作用机制,探讨P5CS基因与其他基因的互作及调控植物抗逆的生理生化机理,研究其在植物生长发育及器官发生等过程中的作用;培育出高效、实用、抗逆性强的转基因植物品种,均有待今后进行深入研究。

小叶杨Δ~1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(P5CS)基因克隆及在杂种落叶松中的转化

以小叶杨为材料构建了干旱胁迫和正常生长条件下的cDNA文库,以特异性引物从中扩增出一条1 850bp大小的DNA片段,经序列分析证实该片段编码Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(P5CS)。将该片段构建入植物表达载体pBI121中,在落叶松杂交育种中利用花粉管通道法将带有该P5CS基因的植物表达质粒转化入杂种落叶松,收获球果取出种子,提取转化种子发芽长出幼芽的DNA,特异性PCR扩增和Southern,Western Blotting检测证实落叶松中已导入P5CS基因。

利用P5CS基因转化白三叶的研究

为了培育抗旱白三叶,构建了植物表达载体pBPC-P5CS,利用基因枪法转化白三叶的愈伤组织,PCR检测和Southern blot鉴定证实白三叶中已导入P5CS基因。对转P5CS基因白三叶植株的不同抗旱指标进行了分析。结果表明,与对照相比,转P5CS基因株系的抗旱能力得到了较大的提高。干旱胁迫下,与对照相比,转P5CS基因植株的脯氨酸含量和相对含水量分别比对照高20.0%-21.2%和5.6%-8.5%。

转PuP5CS基因烟草对低温胁迫的生理响应

以朝鲜碱茅PuP5CS基因(HQ637435)为目的基因,构建了PuP5CS基因的正义表达载体和反义表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,研究了PuP5CS基因对烟草耐寒性的影响。结果显示,低温胁迫下,正义转基因烟草体内可溶性糖、脯氨酸、叶绿素a和叶绿素b的含量均显著高于野生型烟草,丙二醛含量增幅显著低于野生型烟草,提高了转基因烟草的抗寒性,而反义转基因烟草体内各项生理指标变化不明显。

Δ’吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因在水稻上的荧光原位杂交(英文)

脯氨酸的积累与植物对干旱和盐胁迫的抗性有关。P5CS基因编码一个双功能酶 ,具有谷氨酸激酶和谷氨酸 -γ -半醛脱氨酶活性 ,催化脯氨酸合成过程中的前 2步反应。它是脯氨酸合成的限制因子。用生物素标记的荧光原位杂交技术 ,以蛾豆 (Vignaaconitifolia)中克隆到的P5CS基因作探针对水稻进行物理作图。该探针定位于水稻第 9染色体的短臂近端点处 ,信号点距着丝粒的相对距离为 ( 5 1 .79± 1 .2 4 ) %。

大蒜芥Δ′-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(P5CS)的克隆及表达分析

Δ′-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物渗透胁迫下脯氨酸合成谷氨酸的关键酶。利用RACE结合RT-PCR技术克隆获得大蒜芥(Sisybrium altissimum)SaP5CS1基因全长cDNA序列,该基因全长1 907bp,其中开放阅读框为1 719bp,编码573个氨基酸,预测编码蛋白质的等电点为4.95,分子量为156.279kDa。同源分析显示,SaP5CS1与甘蓝型油菜(Brassica napus)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的蛋白序列相似性分别为98%和96%。实时荧光定量PCR分析表明,在干旱逆境胁迫条件下,大蒜芥SaP5CS1基因在根和叶的相对表达量受胁迫的诱导均上调。SaP5CS1基因的克隆及序列分析将为其功能分析和分子育种奠定基础。

拟南芥P5CS1基因转化羽衣甘蓝增强耐盐性分析

【目的】分析转拟南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1)基因羽衣甘蓝的耐盐性,为获得较强的耐盐性羽衣甘蓝品种及其抗逆育种提供理论依据。【方法】将拟南芥P5CS1基因(AtP5CS1)经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植物中,在盐胁迫下,分别检测转基因植株与野生型植株的AtP5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、株系根系性状、整株干质量和鲜质量、叶片相对水含量、叶片电导率和整株存活率。【结果】在150 mmol/L NaCl胁迫下,转基因植株的P5CS1基因mRNA可正常表达,与对照相比,转基因株系Y1、Y2的主根和最长侧根长度较长,侧根数目较多,整株干质量和鲜质量较重;而且相对水含量显著高于对照植株(P<0.05,下同),脯氨酸含量及存活率均极显著高于对照植株(P<0.01),叶片相对电导率显著低于对照植株。【结论】转AtP5CS1基因植株的耐盐表型优于对照,即AtP5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性。

木薯MeP5CS和MeP5CR基因克隆及其干旱胁迫下的表达分析

在不同浓度(0、20%、30%、40%、50%)PEG处理下考察木薯(Manihot esculenta Crantz)叶片中脯氨酸含量的动态变化。从木薯中分别克隆了Me P5CS和Me P5CR基因,对其序列进行生物信息学分析,并分析了Me P5CS和Me P5CR基因在20%PEG胁迫处理下各组织中的表达。结果表明,脯氨酸含量受渗透胁迫快速诱导,在一定范围内随PEG浓度升高而明显升高,表现出较好的相关性。序列分析表明,Me P5CS基因c DNA全长2 217 bp,编码738个氨基酸,含有P5CS保守结构域;Me P5CR基因c DNA全长828 bp,编码275个氨基酸,含有P5CR保守结构域,它们分别与麻风树和蓖麻中的P5CS、P5CR亲缘关系较近。Me P5CS和Me P5CR基因在转录水平受到渗透胁迫的调控。

利用基因枪共转化法获得转bar与P5CS基因黑麦草

以多年生黑麦草(LoliumperenneL.)种子成熟胚为外植体进行高效诱导愈伤组织的组培条件,在此基础上用基因 枪法轰击其成熟胚的愈伤组织,共转化分别携带bar基因和P5CS基因表达框架的2种质粒,经1.2‰草丁磷 (Glufosinate)抗性筛选获得了转基因再生植株。经聚合酶链式反应(PCR)检测筛选到整合bar基因的株系18个,遗传转 化率为0.72%,其中5个检测到P5CS,共转化效率为27.8%。

青海野生中国沙棘P5CS基因的扩增及序列分析

以青海野生中国沙棘的嫩叶为材料,扩增其P5CS基因并进行序列测定。结果表明:所得的中国沙棘的P5CS基因的碱基数量为434bp,其中A碱基115个,T碱基119个,G碱基107个,C碱基93个。另外,通过对中国沙棘P5CS基因的氨基酸的序列分析显示,所得P5CS基因片段编码144个氨基酸,其中强碱性氨基酸21个,强酸性氨基酸8个,疏水性氨基酸53个,亲水性氨基酸34个。

转P5CS基因马铃薯“东农303”耐盐、抗旱性研究

利用拟南芥Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶基因（P5CS）进行了马铃薯品种“东农303”的遗传转化，在盐和干旱胁迫下研究转基因植株的耐盐性和抗旱性。经 PCR 扩增，证实 P5CS 基因已整合到马铃薯基因组中。用150 mmol／L NaCl溶液和干旱（基质含水量为20％～25％）胁迫处理20 d，发现转基因植株叶片的脯氨酸含量显著增加，SOD活性明显上升，而丙二醛积累量则缓慢，从而说明该品种更适合生长在干旱和盐胁迫条件下。

石蒜LrP5CS基因的克隆与表达特性分析

Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物渗透胁迫下谷氨酸途径合成脯氨酸的关键酶。该研究以石蒜(Lycoris radiata)为材料,采用同源克隆、RACE方法结合RT-PCR技术克隆获得LrP5CS基因全长cDNA序列。序列分析表明,LrP5CS基因全长2 521bp,其中开放阅读框(ORF)为2 139bp,编码713个氨基酸,预测编码蛋白质的分子量为77.19kD,等电点为6.34;LrP5CS是1个稳定的疏水蛋白,不含信号肽,不具有跨膜结构,具有AAK超基因家族和ALDH-SF超基因家族的保守结构域。氨基酸序列比对和系统进化树分析发现,LrP5CS与植物其他P5CS蛋白具有较高的一致性,且与海枣PdP5CS及油棕EgP5CS聚为一类,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明,LrP5CS在根、鳞茎和叶片中均有表达,其中在鳞茎中的表达量最高。LrP5CS在20%聚乙二醇(PEG)处理下的表达模式分析发现,LrP5CS受PEG胁迫处理的诱导表达,其基因相对表达量在处理后6h达到最高;随着处理时间的延长,LrP5CS基因相对表达量水平逐渐下调至对照水平。将LrP5CS连接到表达载体pET-28a上,转化获得LrP5CS编码基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物发现成功表达目的蛋白。该研究结果为进一步分析LrP5CS基因功能及石蒜抗逆分子育种奠定了基础。

甘蔗Δ~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(ScP5CS)基因分离及其分析(英文)

以甘蔗品种ROC22为材料,待甘蔗生长至4～5叶期直接以25%PEG6000淋灌根部模拟水分胁迫。采用同源克隆与RT-PCR法从甘蔗叶片中得到甘蔗Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Saccharum officinarum L.Δ1-pyrroline-5-carboxy-late synthetase,ScP5CS)基因的编码区cDNA序列,其长度为2151 bp,为一个完整的ORF,编码716个氨基酸,GenBank注册号为EU005373。核苷酸序列与前人已注册的甘蔗P5CS(EF155655)相比,同源率达到98%,但推断编码的氨基酸同源率仅为92%。该基因具有P5CS共有的结构域与结合位点:Putative ATP-binding site;Putative leucine domains;Glu-5-kinase domain;Putative NADPH-binding domain;Conserved GSA-DH domain保守区,脯氨酸反馈抑制作用位点。与前人已注册的甘蔗P5CS基因氨基酸序列(ABM30223)比较,在γ-GK保守域(Glu-5-kinase domain)内氨基酸变化较大,而与水稻、小麦的相比,其变化较小。因此,推断为甘蔗P5CS基因家族中的一个新成员。

野生大豆P5CS基因的克隆及对盐胁迫反应

逆境下植物大量积累脯氨酸是减轻胁迫伤害的一种自我保护机制。本研究应用同源克隆方法从NaCl处理的野生大豆中克隆获得一个脯氨酸合成酶(P5CS)基因,命名为GsP5CS。该基因核苷酸序列全长2.232 kb,含一个2148bp开放阅读框,编码715个氨基酸,包含有高等植物P5CS蛋白质的5个主要功能域,与菜豆PvP5CS1基因核苷酸序列相似性高达98.79%。Real Time PCR分析显示该基因受轻度盐胁迫诱导上调表达,根中表达高峰出现在200 mmol/L NaCl处理下,相对表达量为对照的5.83倍;叶片中表达高峰出现在300 mmol/L NaCl处理条件下,相对表达量为对照的12.78倍。并且该基因在根和叶片中的表达模式和脯氨酸含量的变化模式相同。上述结果说明,GsP5CS可能参与野生大豆脯氨酸合成。

SgP5CS基因克隆和生物信息学分析

利用同源克隆的方法,获得了碱蓬P5CS基因全长ORF,命名为SgP5CS。SgP5CS ORF全长2 151 bp,生物信息学软件预测其编码716个氨基酸组成的多肽,相对分子量为77 431.8 u,等电点为5.71,为稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构域。Clustal X多重序列比对发现SgP5CS编码的氨基酸序列与盐角草P5CS相似性为93%,与盐角草P5CS的亲缘关系最近,其次是甜菜。脯氨酸是生物体内重要的渗透调节剂,而Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶则是植物合成脯氨酸的关键酶之一,SgP5CS的克隆将为进一步的功能分析鉴定基础。

柴达木盆地梭梭P5CS基因的扩增及序列分析

以柴达木盆地梭梭同化枝为材料,扩增其P5CS基因并进行序列测定。结果表明:所得柴达木盆地梭梭P5CS基因的碱基数量为442个,编码146个氨基酸。另外,同源性比对分析结果显示梭梭与甜菜、可可等植物的P5CS基因具有较高的同源性。研究结果将为下一步梭梭P5CS基因的结构与功能研究奠定基础。