氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞磷酸酶PTEN活性的影响

为探讨氧化型低密度脂蛋白促血管平滑肌细胞增殖的细胞内信号转导机制 ,将兔血管平滑肌细胞分为对照组、低密度脂蛋白组和氧化型低密度脂蛋白组。以细胞计数和噻唑蓝比色法测定细胞增殖能力 ,Westernblot定量与细胞骨架蛋白同源在 10号染色体有缺失的磷酸酶 (PTEN)表达水平 ,免疫沉淀和特异底物diC1 6 PIP3脱磷酸绿色试剂法检测该磷酸酶活性。实验发现氧化型低密度脂蛋白 (5 0mg L)可使细胞计数及噻唑蓝比色吸光值分别增加 1.78和 3.2 1倍 ,而低密度脂蛋白 (5 0mg L)无明显作用。各浓度低密度脂蛋白及氧化型低密度脂蛋白对该磷酸酶蛋白表达水平均无显著影响。氧化型低密度脂蛋白对PTEN活性的抑制在 2 0～ 5 0mg L范围内呈浓度依赖性。时间曲线表现为 10min作用最强 ,并可持续达 2 4h(与对照组比较 ,均P <0 .0 1)。结果提示 ,氧化型低密度脂蛋白可能通过对负性调节蛋白PTEN磷酸酶的抑制而发挥促进血管平滑肌细胞增殖功能。

肿瘤抑制基因PTEN对体外活化肝星状细胞骨架蛋白vinculin的影响

目的探讨第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)表达变化对体外活化肝星状细胞(HSC)纽蛋白(vinculin)的影响。方法分别将含有野生型PTEN基因及含有靶向PTEN的RNA干扰序列短发夹RNA(shRNA)的重组腺病毒转染体外培养的活化大鼠肝星状细胞系HSC-T6,构建体外活化大鼠肝星状细胞PTEN过表达及低表达模型;应用免疫荧光法并结合激光扫描共聚焦显微镜技术检测活化HSC的vinculin分布及表达。实验分组:(1)Control组:以无血清无抗生素的DMEM培养液代替腺病毒液转染体外活化HSC;(2)Ad-GFP组:以仅带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的载体空病毒Ad-GFP转染体外活化HSC;(3)Ad-PTEN组:以带有GFP基因并携带野生型PTEN基因的重组腺病毒Ad-PTEN转染体外活化HSC;(4)Ad-shRNA/PTEN组:以带有GFP基因并携带靶向PTEN的shRNA的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN转染体外活化HSC。结果外源性野生型PTEN基因及靶向PTEN的shRNA成功转染体外活化HSC,并成功构建体外活化肝星状细胞PTEN过表达及低表达模型。HSC的vinculin蛋白主要表达于胞浆,4组HSC的vinculin亚细胞分布未发生明显变化。Ad-PTEN组HSC的vinculin蛋白荧光强度(251.78±12.68)明显低于Control组(381.13±9.12)及Ad-GFP组(383.87±12.15),P<0.05;而Ad-shRNA/PTEN组HSC的vinculin蛋白荧光强度(770.77±20.12)显著高于Control组及Ad-GFP组(P<0.05);但Control组与Ad-GFP组之间HSC的vinculin蛋白荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PTEN表达变化对体外活化肝星状细胞骨架蛋白vinculin的亚细胞分布无明显影响,但PTEN过表达可下调体外活化肝星状细胞骨架蛋白vinculin的表达,而PTEN低表达则可上调体外活化肝星状细胞骨架蛋白vinculin的表达。