基于蛋白质芯片技术筛选与甲型流感病毒NS1蛋白互作的宿主因子及通路分析

目的筛选出与流感病毒Non-structural protein 1(NS1)蛋白结合的人类宿主蛋白并加以分析,确定这些结合蛋白富集的方向及关键蛋白,为抗流感病毒的新药研发提供思路。方法将NS1样本、Biotin样本分别与HuProt^(TM)人类蛋白质组芯片进行杂交孵育,以两重复均满足Z-Score≥3为筛选条件对与NS1蛋白有结合的宿主蛋白进行筛选得到特异性检出蛋白,实验组(NS1蛋白)与对照组(Biotin)比值I Mean_Ratio≥1.4为条件筛选出显著特异性检出蛋白。用检出的195个蛋白进行GO(Biological Process,Molecular Function,Cellular Component)和KEGG_PATHWAY分析,通过蛋白-蛋白相互作用(PPI)及MCODE分析得到关键蛋白。结果获得显著特异性检出蛋白195个,GO分析结果显示这些蛋白主要参与了mRNA加工、RNA结合、蛋白结合,KEGG分析主要富集到RNA降解、氨基酸的生物合成等通路。得到的4个关键蛋白DDX6、HSPD1、PKLR、MTHFD1中DDX6与RNA的合成、翻译等过程相关,而NS1蛋白可以通过调控流感病毒RNA和宿主RNA促进病毒的感染,推测DDX6可能在该过程发挥作用;其他3个蛋白目前虽然没有明确的研究指明其与流感病毒有关系,但是能在其他RNA病毒的感染过程中发挥作用。结论与NS1结合的人类蛋白主要富集到RNA合成、加工、转录等过程中,MCODE分析得到的关键蛋白有潜力成为抗流感病毒新的靶点,但作用机制需要后续实验进行进一步验证。

基于蛋白芯片技术筛选艾炷灸改善CTX骨髓抑制模型的差异蛋白研究

目的:应用蛋白芯片技术筛选环磷酰胺(CTX)诱导的骨髓抑制小鼠模型的差异蛋白,从蛋白水平揭示艾炷灸改善CTX骨髓抑制机制。方法:将C57BL/6实验小鼠随机分为对照组、模型组和艾灸组,实验结束后检测各组小鼠外周血细胞数量,并从各组抽取3例血清样本,采用抗体蛋白芯片检测并分析3组间的差异蛋白。结果:艾灸组小鼠外周血WBC、Mon、Gra、PLT、RBC的数量高于对照组(P<0.05),蛋白芯片共筛选出差异蛋白12种,对照组与模型组间的差异蛋白为10种,分别是:ICAM-1、MIP-1g、BLC、TNF RI、TNF RII、PF4、IL-1a、IL-4、IL-10、IL-17;艾灸组与模型组间的差异蛋白有2种,分别是MIP-1g、TNF RI;最终得出共同差异蛋白为:MIP-1g、TNF RI。结论:艾炷灸改善CTX骨髓抑制模型的血清差异蛋白为MIP-1g、TNF RI,其起效机制可能是通过调节外周血细胞因子MIP-1g和TNF RI的表达实现造血干细胞的动员。

替普瑞酮通过E3泛素连接酶CHIP减轻LPS引起的心肌炎症反应和心功能障碍

目的:探究替普瑞酮又称香叶基香叶基丙酮,GGA)对脂多糖(LPS)诱导的心功能障碍的治疗作用及机制。方法:(1)取8周龄C57BL/6雄性野生型小鼠和热休克蛋白70(HSP70)羧基末端相互作用蛋白(CHIP)基因敲除小鼠,随机分为对照组、LPS组、LPS+GGA组和GGA组,每组8只。用腹腔注射LPS(25 mg/kg)的方法建立模型,于LPS刺激后1 h给予小鼠腹腔注射GGA(100 mg/kg)。利用小动物超声系统评估小鼠心脏功能;采集各组小鼠血清,检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)水平;HE染色观察病理学改变;ELISA检测心脏组织中炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的水平;Western blot检测各组心脏组织HSP70、CHIP、核转运蛋白α2(KPNA2)、髓过氧化物酶(MPO)、血管细胞黏附分子(VCAM)和细胞间黏附分子(ICAM)的蛋白表达以及细胞核NF-κB的水平。(2)利用小鼠心肌细胞HL-1,建立LPS刺激的离体细胞炎症模型。ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-6的水平;Western blot检测心肌细胞中HSP70、CHIP和KPNA2蛋白表达;免疫荧光染色观察细胞核NF-κB的表达。结果:(1)GGA有效改善LPS刺激小鼠的心脏功能,显著提高射血分数和左室短轴缩短率(P<0.01),减少血清CK-MB和LDH含量(P<0.01),减轻心肌损伤。(2)GGA显著减少LPS引起的TNF-α和IL-6炎症因子的释放(P<0.01),以及NF-κB的入核,降低心肌组织中KPNA2、MPO、VCAM和ICAM蛋白表达,增加心肌组织和细胞HSP70的水平(P<0.01)。(3)在CHIP基因敲除的心肌细胞和小鼠中,GGA不能抑制LPS引起的炎症反应,失去了改善LPS刺激小鼠心脏功能的作用。结论:GGA能够减轻LPS引起的心功能障碍,其作用机制与升高HSP70的表达,促进CHIP的活化,减少NF-κB的入核,抑制炎症因子的释放有关。CHIP的敲除使GGA丧失了减轻LPS诱导的炎症反应和心肌损伤的作用。

高尿酸血症状态下低度炎症的病理特点研究

目的:探讨高尿酸血症(HUA)状态下低度炎症的病理特点。方法:根据体质量随机将迪法克鹌鹑分为正常组、模型组,每组10只。以普通饲料:酵母浸膏粉=4∶1制备食饵,并以该食饵喂养模型组鹌鹑,正常组鹌鹑则自由饮食饮水。分别于造模第10、20、30天检测血清尿酸,血清炎症介质白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-33、IL-2、IL-13、IL-8、IL-17、IL-6、IL-10、IL-12/P40、IL-16、IL-21、C反应蛋白(CRP)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、趋化因子CC配体2(CCL2)及γ干扰素(IFN-γ)、神经突起生长导向因子2(Netrin-2)、五聚蛋白3(Pentraxin 3),观察各炎症介质强度变化;造模第30天,取鹌鹑肝、回肠、肾各脏器组织,进行HE染色后观察组织病理形态变化;造模第20天,用基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析差异炎症介质功能及相关信号通路;用Pearson相关性分析方法分析差异炎症介质与血清尿酸水平的相关性。结果:与正常组比较,模型组鹌鹑血清尿酸水平高(P<0.05),以血清IL-17、IL-6、IL-33等为主的白细胞介素类,以IL-8、CCL2为主的趋化因子类,IFN-γ、TNF-α、CRP及GM-CSF水平均升高(P<0.05),而IL-13、IL-10水平降低(P<0.05)。造模第20天,GO/KEGG富集分析结果显示,HUA状态下的低度炎症可能是尿酸代谢靶点群,通过IL-17、Janus激酶信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)等信号通路激活、细胞因子-细胞因子间相互作用,从而诱导IL-6、TNF-α等炎症介质产生。2组组织病理变化结果显示,与正常组相比,模型组回肠组织黏膜下层可见炎性细胞浸润,肝、肾组织未见明显差异。差异炎症介质与血清尿酸水平的相关性分析结果显示,鹌鹑血清中IL-6、TNF-α、CRP、IL-33、IL-17、IL-8、IFN-γ、CCL2、GM-CSF、IL-1β、IL-2、IL-6水平均与血清尿酸水平正相关,IL-10、IL-13水平与血清尿酸水平负相关。结论:HUA鹌鹑模型存在低度炎症,该低度炎症可能与尿酸代谢靶点群通过IL-17、JAK-STAT等信号通路的激活以及细胞因子间的相互作用,从而调控IL-6、TNF-α等炎症介质的产生有关。

基于流式量子点微球技术的甲乙型流感病毒抗原检测方法的建立和初步应用分析

目的建立基于流式量子点微球技术的甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)抗原联检方法,为常见呼吸道病毒抗原多重检测打下基础。方法分别使用自制的不同量子点编码微球和小鼠抗FluA/FluB核蛋白(NP)单克隆抗体进行偶联,在流式细胞仪上对已知浓度的甲乙型流感病毒抗原分别和同时进行检测,对检测条件进行优化,建立甲乙型流感病毒抗原联检方法,利用此方法对临床样本进行检测,与实时荧光定量PCR法(quantitative real-time PCR,qPCR)进行比对,验证此方法的临床性能。结果建立了甲乙型流感病毒抗原联检方法,该方法的甲乙型流感病毒抗原的检出限分别为26.1 pg/ml和10.7 pg/ml,测量范围均为15.3~250000 pg/ml。对临床样本检测,与qPCR比对一致性良好,阳性符合率为57.4%,阴性符合率为100%,总符合率71.6%,并优于临床常用胶体金试剂(阳性符合率为56.49%,阴性符合率为99.75%)。结论此流式量子点微球多重检测方法可以用于甲乙型流感病毒抗原的联检,其灵敏度较高、特异度好、检测范围广,可以为呼吸道常见病毒多重检测打下良好基础,在临床上具有应用前景。

贝伐珠单抗靶向治疗卵巢癌患者对肿瘤标志物的影响

目的探讨贝伐珠单抗靶向治疗卵巢癌对肿瘤标志物的影响。方法选取2019年1月—2021年12月福建医科大学附属福州市第一医院收治的80例卵巢癌患者,根据不同治疗药物进行分组,分别纳入单独行化疗的化疗组和行贝伐珠单抗靶向治疗的靶向组,每组40例。测评2组治疗前后肿瘤标志物蛋白芯片中糖链抗原125(glycoantigens in protein chips-125,CA-125)、人附睾蛋白4(Human epididymal protein 4,HE4)水平及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平,治疗后客观缓解率、疾病控制率、免疫指标、癌症患者生命质量测定量表(quality of life scale for cancer patients,FACT-G)和抑郁自评量表(self-rating depression scale,SDS)、焦虑自评量表(self-rating anxiety scale,SAS)评分。结果治疗后,靶向组治疗客观缓解率为65.00%,疾病控制率为87.50%,高于化疗组的42.50%、70.00%(P<0.05);靶向组CA-125、HE4、VEGF指标低于化疗组,CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)高于化疗组,FACT-G评分高于化疗组,而SDS、SAS评分低于化疗组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论贝伐珠单抗靶向治疗卵巢癌患者可抑制肿瘤新生血管形成和生长,增强治疗效果,改善患者的心理情绪和生活质量。

T细胞免疫检测和蛋白芯片技术筛查人类免疫缺陷病毒感染者结核潜伏感染的效果分析

目的:分析T细胞免疫检测和蛋白芯片技术筛查人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者结核潜伏感染的效果。方法:选取2021年8月—2023年8月贵阳市公共卫生救治中心收治的HIV感染者86例作为研究对象。对HIV感染者进行T细胞免疫检测及蛋白芯片技术筛查,以结核分枝杆菌培养结果作为“金标准”,比较两种筛查方法检查结核潜伏感染的效能。结果:“金标准”结果显示,86例HIV感染者中66例存在结核潜伏感染。T细胞免疫检测筛查结核潜伏感染的灵敏度、特异度、准确度高于蛋白芯片技术,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:T细胞免疫检测筛查HIV感染者结核潜伏感染的效果优于蛋白芯片技术,灵敏度、特异度、准确度更高,值得临床推广。

三维培养结肠癌细胞的微流控芯片荧光成像研究

改良了一种微流控芯片,可用于对结肠癌细胞进行三维培养并实现实时荧光成像。在结肠癌细胞内植入内源性的红色荧光蛋白,使用激光共聚焦显微镜对芯片中三维培养的细胞进行成像。通过细胞内部红色荧光蛋白的表达,可以观测到细胞的生长状态,实现对细胞的实时监测和高分辨率荧光成像。同时,通过免疫荧光染色来表征反映细胞活性的特征蛋白,其荧光强度和蛋白表达呈正相关。研究结果提示,细胞活性相关蛋白的表达受到微环境的影响,其在芯片三维培养中的活性强于二维培养,表明芯片内环境更加接近真实的人体微环境。该方法为进一步探究肿瘤细胞转移机制及相关药物的筛选研究提供了一种新的技术手段及实验平台。

小分子阿特拉津和罂粟碱检测的免疫芯片技术研究

采用蛋白芯片竞争法对小分子半抗原的污染物进行检测。在获得特异性抗体的前提下,首先将阿特拉津半抗原进行了衍生化,然后将该衍生物和氨基罂粟碱分别与载体蛋白质卵清蛋白(OVA)进行偶联。实验证明新合成的完全抗原能够与其相应抗体发生特异性的结合。实验还对蛋白芯片检测阿特拉津进行了条件优化,其抗体固定化时间为2h,用卵清蛋白为封闭液的封闭时间为1h,样品稀释液pH值为8. 0。并对阿特拉津及罂粟碱进行了定性、定量实验,结果表明:荧光信号强度随待测物浓度的降低而增强,有一定的线性趋势,阿特拉津检出限为0. 001mg/L,罂粟碱检出限为0. 01mg/L。

禽流感、新城疫可目视化诊断蛋白芯片的制备及初步应用

本研究制备了可以同时鉴别诊断禽流感(AI)、新城疫(ND)2种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。以超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了2种病毒蛋白抗原,用点样缓冲液稀释后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;将芯片与待检血清杂交后,再与胶体金标记的二抗杂交,银染显色后根据灰度值判定结果,从而建立了2种禽病的可视化蛋白芯片鉴别诊断方法。采用该方法对18份现地血清样品进行初步检测,结果显示该芯片可特异性的与相应的抗体杂交,无交叉反应,而且呈现较强的杂交信号,其信号灰度值在阳性血清浓度为50μg/mL～300μg/mL范围内成线性关系(Y=0.426X+4.225)。用该芯片方法和琼扩(AGP)抗体检测方法对18份现地样品进行符合率检测,结果表明该可视化蛋白芯片具有很好的特异性,并且检测灵敏度为是AGP方法的400倍以上。研究表明该方法可用于同步鉴别2种禽病,是一种有效的抗体检测新方法。

多肿瘤标志物蛋白芯片检测中铁蛋白在恶性肿瘤中的诊断价值

目的探讨多肿瘤标志物蛋白芯片中铁蛋白在恶性肿瘤中的诊断价值。方法收集25 076例可供分析的多肿瘤标志物蛋白芯片检测结果,分析铁蛋白在恶性肿瘤组(肿瘤组)、良性病变组(良性粗)和健康体检组(健康组)中的阳性率及各种类型肿瘤患者中的阳性率,以及铁蛋白伴随其他肿瘤标志物阳性在各类型肿瘤患者中的情况。结果肿瘤组铁蛋白阳性率明显高于良性组及健康组(P<0.01),阳性率最高的肿瘤类型为胰腺癌(28.9%)。2 011例铁蛋白阳性肿瘤患者中,伴随阳性率最高的肿瘤标志物为糖类抗原125(CA125),其后依次为癌胚抗原(CEA)和糖类抗原19-9(CA19-9),伴随阳性率分别为46.2%、34.0%和29.4%。铁蛋白伴随CA125阳性最常见于卵巢癌(71.19%),铁蛋白伴随CEA阳性最常见于肠癌(58.12%),铁蛋白伴随CA19-9阳性最常见于胰腺癌(72.73%)。结论多肿瘤标志物中铁蛋白单独升高对判断肿瘤类型意义不大,与其他指标联合检测对肿瘤类型的辅助诊断有一定意义。

多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统在肺癌诊断中的临床意义

目的探讨多肿瘤标志物蛋白芯片检测在肺癌诊疗中的应用价值。方法采用蛋白芯片技术检测肺癌患者308例、肺部良性病变患者218例、健康体检者250例血清中的12种肿瘤标志物(CA199、NSE、CEA、CA242、Ferrtin、β-HCG、AFP、f-PSA、PSA、CA125、HGH、CA153)水平。结果肺癌组阳性率为72.4%,显著高于良性病变组的22.0%和健康对照组的5.6%(P<0.01);不同病理类型的肺癌患者阳性率存在差异,腺癌中CEA、CA125、CA153的阳性率和含量明显高于鳞癌(P<0.05),有淋巴结转移组的阳性率71.9%,明显高于无淋巴结转移组的52.1%(P<0.05)。结论多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统对肺癌的辅助诊断和疗效监测有较高的临床价值。

结核蛋白芯片检测诊断结核病的价值

目的探讨结核蛋白芯片检测诊断结核病的价值。方法使用结核蛋白芯片系统检测4 093例患者的血清结核抗体,其中结核病441例,非结核病3 652例。采用结核蛋白芯片技术检测结核分枝杆菌中ESAT-6、CFP10、LAM、38KD和16KD 5种成分,分析其结果。结果 441例结核患者中297例结核抗体阳性,3 652例非结核患者中,647例阳性,结核蛋白芯片检测的灵敏度为67.35%,特异度为82.28%。结论结核蛋白芯片是诊断结核病的较有效方法,具有特异性好、快速方便等优点,对快速诊断结核病起辅助作用。

蛋白芯片应用研究进展

蛋白芯片作为一种快速、简便、高通量分析检测技术,近年来在食品检验、蛋白质组学、疾病诊断、药物筛选、农林畜牧业以及司法鉴定等领域应用日渐增多。本文简述蛋白芯片的应用、存在的问题和未来发展前景。

蛋白质芯片技术

以前对蛋白质的研究集中在一次研究一种蛋白质 ,通常费时费力 ;而蛋白质芯片技术是研究蛋白质组的新技术 ,是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。它可以用来研究蛋白质的亚细胞定位和蛋白质与蛋白质之间的相互作用 ,以及对蛋白质的功能进行生物化学分析 ,将对蛋白质组研究及医学生物学的发展有很大的推动作用。较系统地介绍了蛋白质芯片的概念、制作及检测方法 ;同时也讨论了蛋白质芯片的两种功能形式、存在问题和应用前景。

4种禽病毒抗体可视化蛋白芯片的制备及应用

【目的】研制可同时鉴别检测AI、ND、IB、IBD等4种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。【方法】用超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了4种病毒蛋白抗原,调整到合适浓度后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;分别用4种禽病阳性血清杂交,再与金标二抗杂交,银染显色后读取结果,建立4种禽病的可视化蛋白芯片工作平台;进一步对此芯片的特异性以及灰度值与抗体浓度的相关性进行了研究;最后对18个现地血清样品进行了初步应用检测。【结果】结果显示经过条件优化后,芯片检测探针可特异性的相应的抗体进行杂交,呈现较强的杂交信号,且无交叉杂交。信号灰度值在抗体浓度为50～300μg·ml-1范围内成线性关系。用芯片和其它传统抗体检测方法同时检测18份现地样品,结果发现可视化蛋白芯片具有很好的特异性,并且灵敏性明显高于传统检测手段。【结论】研究表明该方法可用于同步鉴别4种禽病抗体,是一种有效的抗体检测新方法。

多肿瘤标志物蛋白质芯片检测系统对结直肠癌诊断的临床意义

目的探讨多肿瘤标志物蛋白质芯片检测系统(C-12)在结直肠癌诊断中的临床意义,并建立联合诊断结直肠癌的函数,以提高肿瘤标志物诊断结直肠癌的准确率。方法采用蛋白质芯片法检测239例结直肠癌、79例结直肠良性病变和1 203例正常体检者12项肿瘤标志物的水平,并建立联合诊断函数。结果(1)结直肠癌组蛋白芯片的阳性率为71.97%,显著高于结直肠良性病变和正常体检组。C-12芯片检测结直肠癌的灵敏度是71.97%,特异度是55.7%,阳性预测值是83.09%,阴性预测值是39.64%;联合检测的阳性率显著高于单项肿瘤标志物的检测(P<0.05)。(2)CA199、CEA、CA242、AFP、-βHCG,HGH以及CA125阳性率明显高于良性病变组和正常体检组(P<0.05),同时CA199、CEA、CA242和CA125联合检测的灵敏度和准确率明显高于单项检测指标。(3)CA199、CEA、CA242以及CA125表达强度和肿瘤预后相关。(4)建立结直肠癌判别诊断函数,对肿瘤的诊断准确率为86.4%,显著高于联合检测。结论联合检测多肿瘤标志物对结直肠癌的诊断和预后判断具有重要意义。本研究建立的联合诊断函数能提高结直肠癌诊断准确率。

利用H4和SAX-2蛋白质芯片技术筛查少精子症患者精浆标志物

目的:通过蛋白质组学技术筛查少精子症患者精浆中特异性生物标志物。方法:用H4和SAX-2蛋白质芯片结合SELD I-TOF-MS对20例少精子症患者及20例生育男性精浆样本进行检测,比较两者间蛋白质图谱表达差异。结果:在H4蛋白质芯片上,少精子症患者精浆与生育男性精浆蛋白质图谱相比,有1处蛋白质峰明显增高,差异有显著性(P<0.05),其相对分子质量(Mr)为11 507.4,有1处蛋白质峰明显降低,差异有显著性(P<0.05),其Mr为11 022.9;在SAX-2蛋白质芯片上,少精子症患者精浆与生育男性精浆蛋白质图谱相比有1处蛋白质峰明显增高,差异有显著性(P<0.05),其Mr为16 751.6。结论:少精子症患者精浆中特异性蛋白质的发现,对探究由少精子症引起的男性不育机制及其临床筛查皆具重要意义。

抗结核分枝杆菌多种抗原的抗体检测蛋白芯片研究

目的 建立检测结核分枝杆菌多抗原IgG抗体的蛋白芯片检测系统 ,并验证抗结核分枝杆菌多种抗原的抗体检测蛋白芯片的临床应用价值。 方法 采用棋盘滴定法标定检测结核菌抗体的包被蛋白及金标记二抗的最低工作浓度 ,建立完整的检测系统。结核病人和正常对照者的血清经芯片识别仪和DIGFA法试剂同时检测 ,计算敏感性、特异性和总符合率。 结果 结核芯片系统检测的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和诊断效率分别为76 74% (3 5 3 /4 60 )、81 70 %、5 6 48%、91 90 %和 15 8 44 %。而DIGFA法检测的敏感性、特异性分别为 68 3 1% (2 91/4 2 6)和 72 2 %。两者检测的总符合率为 85 2 1%。检测结果间无显著性差异 (χ2 =6,P >0 0 5 )。全部检测过程只需 5min。 结论 芯片系统检测的敏感性和特异性符合临床检验要求 ,具有简便、快速和单人份操作的优点 ,可用于临床快速诊断结核病。