鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株YG97经 10日龄鸡胚增殖后纯化 ,提取病毒的基因组RNA ,采用RT_PCR一次性扩增出与预期设计的 1.7kb大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入pGEMR_T载体 ,经转化、筛选及酶切鉴定后 ,初步获得了含鹅副粘病毒F基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的F基因片段的长度为16 95bp ,共编码 5 5 3个氨基酸 ,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112 R_R_Q_K_P_F117,与NDV的强毒株特征相符 ,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符。同源性分析表明 ,与国内标准强毒株F48E9的核苷酸同源性为 86 % ,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在 82 %～ 89%之间 。

禽I型副粘病毒广西分离株F基因序列及毒力的研究

对源于鸡、鹅、鸽的 9株APMV_1广西分离株及我国常用的中发型疫苗毒株I系 (Mukteswar株 )的F基因N_端前段进行了RT_PCR扩增 ,产物进行核苷酸序列测定 ,用基因分析软件DNAStar进行分析并与已发表的其它参考毒株进行比较。结果发现 ,广西分离株在裂解位点的氨基酸组成和排列均符合强毒株的特征 ;根据F基因绘制的系谱树来看 ,广西鸡和鹅分离株都归属于基因型VII,证实近年来广西流行的基因型与国内其他地区的相同 ;并发现中发型疫苗毒株I系 (Mukteswar株 )也属于基因型VII。研究还对分离株进行了常规的毒力和致病性测定试验 ,并与根据F基因序列特征判定的结果相比较 ,结果发现其中一株鸽源和两株鹅源分离株根据常规方法判定的结果与毒株在临床上的致病性不相符 。

RT-PCR技术诊断猪瘟的应用研究

应用反转录_聚合酶链反应 (RT_PCR)对猪瘟进行诊断应用研究。应用RT_PCR对来自广西不同地区的 135份疑似猪瘟病料进行检测 ,84份诊断为阳性 ,阳性率 6 2 .2 %。从百色、柳州地区等采集的健康猪扁桃体和淋巴结共 2 76份 ,经RT_PCR检测 ,37份为阳性 ,阳性率为 13.4 %。其中健康猪扁桃体带毒较高 ,2 4 6份扁桃体中有 35份阳性 ,占 14 .2%。采自柳州健康猪的 2 6份淋巴结材料全为阴性 ,只有邕宁县的 1份健猪淋巴结阳性。结果表明 。

鸡新城疫病毒强弱毒株RT-PCR鉴别诊断方法

本研究通过对大量不同毒力NDVF基因核苷酸序列分析 ,根据毒力和序列间的相关规律 ,分别设计合成了两组引物 ,建立了一个可以迅速鉴别NDV强、弱毒株的RT_PCR方法 ,对强毒株可扩增出 133bp的特异性片段和 36 2bp的通用片段 ,弱毒株可以扩增出 2 5 2bp的特异性片段和 36 2bp的通用片段。只需一个RT_PCR反应 ,整个实验过程可在 5小时内完成。敏感性测定结果表明该方法的最低检出量不低于 5 0 0pg的NDVRNA。为了增加方法的实用性 。

红豆杉细胞非甲羟戊酸途径关键酶基因dxr的克隆与分析

近几年的研究表明 ,非甲羟戊酸途径可能是紫杉醇合成的主要途径 ,通过对各种不同来源的非甲羟戊酸途径关键酶 5_磷酸脱氧木酮糖还原异构酶 (DXR)基因同源区域进行比较 ,设计出简并引物 ,利用RT_PCR技术从中国红豆杉 (Taxuschinensis)悬浮细胞中扩增出 5 35bp的基因片段。同源序列比对发现 ,推断的蛋白质序列与Arabi dopsisthaliana (Q9XFS9)、Menthaxpiperita (Q9XES0 )、Synechococcuselongatus (Q8DK30 )、Synechocystissp .PCC 6 80 3(Q5 5 6 6 3)、Nostocsp .PCC 71 2 0 (Q8YP4 9)、Synechococcusleopoliensis (Q9RKT1 )的一致性分别达到 95 %、94 %、80 %、78%、78%和 73%。结合蛋白质保守区、特征区以及进化树分析 ,证实该基因确为dxr基因 。

新城疫病毒四平株HN蛋白基因的克隆与序列分析

新城疫病毒 (NDV)四平株在鸡胚增殖后纯化 ,提取RNA ,然后利用特异性引物 ,经RT_PCR一次性扩增出了NDV四平株的全长HN基因。将该HN基因插入pKS(_)后测序。序列分析表明 ,该HN基因核苷酸长度为 1 742bp ,编码 5 71个氨基酸 ,序列中有 5个糖基化位点 ,1 2个半胱氨酸残基。同源性分析表明 ,四平株HN基因与目前国外发表的其他NDVHN基因相比 ,核苷酸序列同源性在 83.4%_89.2 %之间 ,推导的氨基酸序列同源性在 87.6 %_91 .1 %之间。

应用多重反转录-聚合酶链反应检测鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的研究

本文建立了一种同时检测NDV和IBV二种病原体的多重PCR技术。根据NDV和IBV的基因文库 ,设计了两对分别与NDV和IBV某段基因序列互补的引物 ,用这两对引物对同一样品中NDV和IBVRNA模板进行多重RT_PCR扩增 ,结果均同时得到了两条特异性的大小与实验设计相符的 31 0bp(NDV)和 1 72 0bp(IBV)多重的RT_PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果表明 ,该多重RT_PCR技术能同时检出 1 0pg的NDV和 1 0 0pg的IBVRNA模板。

TrkA及PPTA mRNA在咬合创伤犬三叉神经节内的表达变化

目的:观察咬合创伤时犬三叉神经节(TG)中神经生长因子受体TrkA mRNA及前速激肽原-A(PPTA)mRNA的表达变化,探讨咬合创伤导致口面痛的可能机制。方法:将高出咬合面1.5 mm的镍铬合金嵌体粘同于10只杂种犬右侧上颌第一、二磨牙咬合面的一类嵌体洞形内,造成对(牙合)牙的创伤。粘固嵌体后3、7、14、30、60天时取双侧TG。用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TG中TrRA及PPTA mRNA的表达变化并与无咬合创伤的对照组作比较。结果:(1)创伤后3-60天内创伤侧TG的TrkA和PPTA mRNA表达水平比对侧明显上调。(2)刨伤侧TrkA mRNA的表达量在3-60天内均高于对照组,7-30天内维持较高水平。(3)3-30天内PPTA mRNA水平明显高于对照组,3-14天达到最高,60天组与对照无差异。结论:咬合创伤能导致TG内TrkA mRNA及PPTA mRNA表达水平的上调。TrkA和PPTA可能参与了咬合创伤所导致的口面痛。

应用反转录聚合酶链式反应检测鸡Th1样淋巴因子mRNA表达的研究

应用反转录聚合酶链式反应(RT_PCR) 和限制性酶切分析技术对鸡脾细胞体外受到有丝分裂原ConA刺激的情况下,其Th1 样淋巴因子mRNA的表达水平进行了研究。实验结果表明,ConA诱导培养3 小时的鸡脾细胞表达α_干扰素(ChIFN_α) 、γ_干扰素(ChIFN_γ)和白细胞介素_2(ChIL_2) 等鸡的Th1 样淋巴因子mRNA。未诱导但培养了3 小时的鸡脾细胞可表达ChIFN_α和ChIFN_γmRNA,而未检测到ChIL_2m RNA的表达。正常SPF鸡的脾细胞可表达ChIFN_αmRNA。本研究应用不同公司生产的反转录酶和Taq 多聚酶,取得了相同的结果。表明该方法具有很好的重复性,而且该法敏感而方便。

鸽I型副粘病毒的RT-PCR套式PCR检测方法的建立

对 3个中国广东的鸽I型副粘病毒分离株 (P4、P5和P7)基因组RNA以反转录 聚合酶链反应法 (RT_PCR)扩增了F基因 75 %的基因区域 ( 3 4 3～ 1673nt)。其中毒株P4和P7准确扩增出预期大小明亮的DNA片段 ,而P5扩增出片段很淡 ,用该RT_PCR产物作模板以相同引物再作PCR ,结果可以扩增出大小与预期一致的明亮条带。此方法可快速检测鸽I型副粘病毒(PPMV_1)。

实验性脾虚证平滑肌细胞VIP受体信号传导障碍

[目的]以血管活性肠肽 (VIP)受体为研究对象 ,在胃肠肽平滑肌细胞受体 (信号接收系统)水平测定实验性脾气虚证大鼠胃肠动力紊乱的信号传导障碍以及香砂六君子汤治疗机制。[方法]逆转录聚和酶链反应 (RT -PCR)法测定胃、空肠和降结肠的VIP两种受体VIPR1和VIPR2mRNA的分布及半定量分析。[结果]在胃窦部 ,仅有VIPR2表达。与对照组相比 ,脾气虚组VIPR2mRNA含量降低 ;治疗组VIPR2含量明显升高。在空肠和降结肠 ,各组VIPR1和VIPR2均有表达 ,各组VIPR1mRNA含量均明显高于VIPR2。脾气虚组VIPR1、VIPR2mR NA含量低于对照组 ;治疗组VIPR1、VIPR2mRNA含量明显高于自然恢复组。[结论]VIP受体在胃肠道不同部位的分布差异可能与脾气虚所致胃与肠道肠动力紊乱表现的截然不同有一定关系 。

鸡传染性支气管炎病毒T株核衣壳蛋白基因(N)的克隆及序列测定

根据IBV病毒已报道基因序列设计了一对用于扩增鸡传染性支气管炎病毒T株核衣壳蛋白基因 (N)的引物 ,经RT_PCR得到了预期大小的扩增产物 ;将目的条带纯化并回收以后 ,克隆到pMD18_T质粒载体中 ,对插入片段进行序列测定 ,并与已发表的IBVN基因序列进行了比较和分析 ,表明具有高度相似性。

应用复合RT-PCR诊断禽支原体与其他呼吸道病原的混合感染

在一个RT_PCR反应中同时以鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)、禽流感病毒 (AIV)、鸡新城疫病毒 (NDV)、鸡传染性喉气管炎病毒 (ILTV)、鸡毒支原体 (MG)和鸡滑坡液囊支原体 (MS) 6种呼吸道病原的RNA或DNA为模板进行扩增。结果显示 ,6种病原都扩增出了相应大小的特异性产物 ,表明建立的复合RT_PCR方法可用于混合感染时上述 6种病原的鉴别诊断。

新城疫病毒野毒株(HBG-1)的F蛋白部分序列同源性分析

采用RT_PCR方法对分离自河北省某鸡场的一株新城疫病毒 (HBG_1)的核苷酸进行扩增 ,获得了分离株F0 裂解位点附近的基因片段 ,经测序分析 ,并与国际上已发表的新城疫病毒的核酸序列进行比较 ,结果表明其与标准株和疫苗株之间的同源性较低 ,仅为 82 %～ 86 %之间。运用计算机软件对其裂解位点处的氨基酸顺序进行预测和分析 。

鹅副粘病毒F和HN基因的克隆及原核表达载体的构建

根据发表的鹅副粘病毒SF0 2株全基因组序列 ,分别设计合成一对引物和二对引物 ,分别采用RT_PCR方法和RT_套式PCR扩增出与预期设计大小相符的F基因和HN基因特异性条带。将扩增出的DNA片段克隆到pMD18_T载体中 ,转化TGI感受态细胞 ,经AMP/IPTG/X_Gal平板筛选 ,酶切鉴定 ,获得阳性重组质粒。对重组质粒进行序列测定 ,结果表明 :鹅副粘病毒JS/ 1/ 97/Go株F基因全长 16 6 2bp ,编码 5 5 3个氨基酸残基 ;F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112 R_R_Q_K_R_F117,与NDV的强毒株特征相符。HN基因全长 1716bp ,编码 5 71个氨基酸残基。将F基因插入到原核表达质粒pGEX_6P_1的EcoRⅠ、XhoI多克隆位点之间 ,转化到TGI感受态细胞中 ,获得了表达F基因的阳性亚克隆重组质粒 ;将HN堪因插入原核表达质粒pProEXHTb的XBaⅠ、XhoⅠ多克隆位点之间 ,转化到TGI感受态细胞中 。

H_5N_1亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及分子进化分析

用RT＿PCR法,以1株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了NP全基因cDNA。将cDNA克隆于pMD18＿T载体,并对其进行测序。测序结果表明所克隆的1542个核苷酸的片段包含了核蛋白完整阅读框架,其中编码区为1497个核苷酸,编码498个氨基酸。将其序列与6株A型流感病毒NP基因序列进行比较,各毒株之间NP基因核苷酸序列同源性为92 5%～95 9%,编码的氨基酸同源性为97 0%～98 4%。本研究通过分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系。

大鼠肝再生增强因子的基因克隆

目的克隆大鼠肝再生增强因子 (ALR)编码序列 ,并在原核细胞表达。方法按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物 ,从2周龄大鼠肝组织提取RNA ,利用RT_PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区 ;将PCR扩增片断亚克隆到pBV221质粒 ,构建原核表达重组载体 ,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约400bp的ALRcDNA编码区基因 ,序列分析表明与文献报道一致 ;重组克隆经热诱导表达出分子量约15kD大小的蛋白质 ,与预期值一致。结论从2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因 。

RT-PCR检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的研究

根据猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)和猪呼吸道冠状病毒 (PRCV)的基因组核苷酸序列 ,在S基因 (纤突蛋白基因 ) 5′端保守区设计了一对引物P3 /P4,该对引物在TGEV扩增跨幅约为 2 .4kb ;而PRCV由于在此区域存在一约 0 .6kb碱基缺失 ,扩增跨幅约为 1.8kb。用引物P3 /P4对TGEVMiller株、Purdue株和PRCVAR310株分别进行RT_PCR ,根据RT_PCR扩增片段大小可以直接区分TGEV和PRCV。用引物P3 /P4与引物P1/P2 作Nested_PCR ,提高了该RT_PCR的特异性和敏感性 。

RT-PCR法检测污染物甲基汞对调钙质基因表达的抑制

应用RT -PCR方法 ,通过用不同浓度的甲基汞对Hep2B细胞株进行不同时间长短的处理 ,检测其调钙质的mRNA表达水平 ,发现微量的甲基汞处理就可以引起细胞株细胞损伤 ,同时抑制调钙质mRNA的表达 ,进一步证实了在肝脏损伤的病理状态下调钙质基因的表达减少 ,从而为检测环境中甲基汞的含量提供了一个可能的分子生物学手段 .

鸡传染性支气管炎山东A株病毒S_1高可变区基因的克隆

参照国外已发表的M41高可变区S1序列设计一对引物 ,跨度为 1 .7kb左右。采用差速离心法浓缩病毒 ,提取病毒RNA ,经RT_PCR扩增 ,得到与设计同样大小的PCRDNA片段 ,将PCR产物纯化 ,与质粒载体 (pGEM_TEasyVector)连接 ,并转入大肠杆菌JM1 0 9,获取阳性克隆。增菌培养后用小量碱提取法提取质粒 ,利用PCR扩增法与EcoRI酶切分析进行鉴定。对阳性质粒DNA进行测序 ,利用Omiga2 .0、Dnasis等分子生物学软件进行分析 ,并与标准M41株、T株等进行序列比较 ,结果表明 :山东传支A株与标准M41株同源性较高 ,最大同源率为 99% ;与标准T株同源性较差 ,最大同源率为 80 %。理论酶切图谱与M41相同 ,为同一基因型。