绵羊SMAD 4基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】克隆绵羊SMAD同源物4(SMAD4)基因并探究其在绵羊中的生物学功能,为研究SMAD 4基因在毛囊生长发育过程中的调控作用提供依据。【方法】以小尾寒羊皮肤组织cDNA为模板,PCR扩增SMAD 4基因CDS区并克隆测序,对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR检测SMAD 4基因在小尾寒羊和新吉细毛羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、皮肤和肌肉中的表达量。【结果】试验成功克隆小尾寒羊SMAD 4基因CDS区,长1662 bp,编码553个氨基酸。系统进化树分析显示,绵羊SMAD 4基因核苷酸序列与山羊和牦牛的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。生物信息学分析发现,SMAD4蛋白为不含信号肽的非跨膜蛋白,存在磷酸化和糖基化位点,属于亲水性蛋白,主要存在于细胞核中;SMAD4蛋白二级结构以无规则卷曲为主,与三级结构预测结果一致;蛋白互作分析显示,SMAD4蛋白与SMAD2、SMAD1、TGFBR1、TGFBR2、SMAD3等蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果显示,SMAD 4基因在绵羊中广泛表达;与新吉细毛羊相比,小尾寒羊心脏、脾脏和皮肤中SMAD 4基因表达量均显著上升(P<0.05),而肺脏和肌肉中SMAD 4基因表达量均显著下降(P<0.05)。【结论】试验成功克隆绵羊SMAD 4基因CDS区,该基因在绵羊各组织中均有表达,且在小尾寒羊和新吉细毛羊心脏、脾脏、皮肤、肺脏和肌肉中存在显著差异。试验结果为进一步探究绵羊SMAD 4基因调控毛囊发育提供理论依据。

TGFβ1与Smad 4基因在肝细胞癌中的表达及意义

目的探讨TGFβ-Smad信号通路中TGFβ1与Co-Smad(Smad 4)与肝细胞癌的发生、发展的关系。方法采用免疫组化ABC法及原位杂交法(ISH),检测41例肝细胞癌组织与癌旁组织中TGFβ1、Smad 4蛋白、Smad 4 mRNA的表达,以5例外伤性肝破裂手术切除标本作为正常对照。比较HCC组与对照组及HCC癌旁中TGFβ1与Smad 4蛋白、Smad 4 mRNA表达的差异,并进行图像分析。结果正常对照组中TGFβ1呈阴性表达,Smad 4蛋白、Smad 4 mRNA均呈阳性表达;HCC组织中TGFβ1阳性表达率为78.0%(32/41),癌旁组织中为95.1%(39/41),两者比较差异显著(P<0.05);Smad 4蛋白在HCC组织中阳性表达率为48.8%(20/41),在癌旁组织中为78.0%(32/41),两者比较有显著性差异(P<0.01);Smad 4 m RNA在HCC组织中阳性表达率为51.2%(21/41),在癌旁组织中为73.1%(30/41),两者比较有显著性差异(P<0.05);与正常肝组织比较,HCC组织中Smad 4蛋白和Smad 4 mRNA阳性表达率均显著降低(P<0.05);Ⅰ、Ⅱ级HCC组织与Ⅲ、Ⅳ级HCC组织Smad 4 m RNA阳性表达存在显著差异(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ级阳性表达率较Ⅰ、Ⅱ级降低;Smad 4蛋白的阳性面积百分比、光密度及Smad 4 m RNA的阳性面积百分比癌旁组织均显著高于HCC组织(P均<0.05)。HCC组织中Smad 4蛋白、Smad 4 m RNA表达与TGF-β1表达比较均存在显著差异(P<0.05),但均无显著相关性(P>0.05)。结论TGFβ1过表达、Smad 4表达缺失可能在肝细胞癌的发生、发展中发挥重要作用。

Smad 4基因在鼻咽癌CNE2细胞中的突变分析

目的:研究CNE2细胞中Smad4基因的突变。方法:运用RT-PCR方法从CNE2细胞中克隆人Smad4cDNA序列,然后与正常鼻咽组织及GenBank序列进行比较分析。结果:CNE2细胞中Smad4基因没有发生任何形式的突变。结论:CNE2细胞可能是一种非Smad4突变的恶性肿瘤,构建的含有人Smad4编码序列的重组质粒,为今后开展Smad4基因的功能研究奠定了基础。

抑制BMP/Smad信号通路对水牛卵巢颗粒细胞生长和类固醇激素合成的影响

【目的】探究BMP/Smad信号通路对水牛卵巢颗粒细胞生长和类固醇激素合成的影响。【方法】利用脂质体转染的方法将合成的Smad 4基因的3对siRNAs(Smad4-siRNA1、Smad4-siRNA2和Smad4-siRNA3)和NC-siRNA(对照组)分别转染水牛颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR检测Smad 4基因的表达水平,比较不同siRNA的干扰效率。然后利用筛选的干扰效率最高的siRNA,转染水牛卵巢颗粒细胞,通过CCK-8法检测对照组和干扰组细胞的增殖情况,实时荧光定量PCR检测上述两组细胞凋亡相关基因Bax和Bcl2,细胞周期相关调控基因CyclinD2和CDK4,以及类固醇激素合成相关基因Cyp19A1和Cyp11A1的表达水平,并通过ELISA检测雌二醇(E 2)和孕酮(P 4)的含量。【结果】基因干扰试验结果表明,3对siRNAs对Smad4基因的表达均具有极显著的干扰作用(P<0.01),其中Smad4-siRNA1的干扰效率最高,达到了64%。CCK-8检测结果显示,与对照组相比,干扰组细胞的增殖效率显著降低(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,干扰组Bcl2、CyclinD2、CDK4和Cyp19A1基因的表达量均显著或极显著下调(P<0.05;P<0.01),而Cyp11A1基因的表达极显著上调(P<0.01),Bax基因的表达未受影响。ELISA检测结果表明,与对照组相比,干扰组雌二醇分泌量减少10.2%,孕酮的分泌量增加24.7%,差异均显著(P<0.05)。【结论】通过RNAi介导的Smad 4基因沉默对内源性BMP/Smad信号通路的中断不仅能够显著抑制水牛颗粒细胞的生长,而且能够诱导水牛颗粒细胞的凋亡,还会改变类固醇激素生成。BMP/Smad信号通路在调控水牛颗粒细胞生长和类固醇生成过程中具有重要的作用。

NR2F2基因调控猪PK15细胞增殖和凋亡的研究

旨在探究NR2F2基因对猪PK15细胞增殖和凋亡的影响。本研究在猪PK15细胞中过表达NR2F2基因,通过qRT-PCR、Western blot、CCK-8、EdU、流式细胞术、划痕试验等方法检测了过表达NR2F2基因对细胞增殖的影响;采用CO-IP技术验证NR2F2与Smad4蛋白结合能力;用qRT-PCR方法检测了NR2F2基因对Smad 4基因表达以及下游基因Cyclin B、CDK1、CDK4、Cyclin D 1表达的影响;挽救试验过表达NR2F2基因且干扰Smad 4基因检测下游基因及增殖基因Ki67、PCNA的表达。结果发现,过表达NR2F2基因极显著上调了Ki 67基因的表达(P<0.01),显著上调了PCNA的表达(P<0.05),促进了细胞周期的进程,抑制了细胞凋亡,促进了细胞的增殖。CO-IP结果证明了NR2F2与Smad4蛋白物理性结合,且发现过表达NR2F2基因后,Smad 4基因表达显著上升(P<0.01),Smad 4基因调控的下游基因Cyclin B、CDK1、CDK4、Cyclin D 1表达显著升高(P<0.01);干扰NR2F2基因后,Smad 4基因表达显著下降(P<0.01),Smad 4基因调控的下游基因表达显著降低(P<0.01)。挽救试验发现,过表达NR2F2基因后,干扰Smad 4基因的表达,能显著降低Cyclin D1、Cyclin B、CDK 1以及Ki67、PCNA的表达(P<0.01,P<0.05)。本研究结果表明,过表达NR2F2基因后促进了细胞的增殖,抑制凋亡,且NR2F2蛋白能与Smad4蛋白结合并影响Smad 4基因的表达,进而影响下游基因的表达。

反义Smad_4基因转染对抗昆明小鼠肝脏纤维化发展的效果观察

目的探讨反义Smad4基因阻断TGF β信号传导系统对抗小鼠肝脏纤维化的效果。方法将反义Smad4基因导入CCl4 /乙醇诱导的昆明小鼠纤维化肝脏 ,用Southernblot检测整合情况 ,用Northernblot、RT PCR及Westernblot方法观察Smad4的表达 ,比较各组小鼠肝脏纤维化程度。结果反义Smad4基因可整合到病毒处理组小鼠肝脏。纤维化肝脏Smad4表达较正常组明显增强。经转基因处理后 ,小鼠纤维化肝脏Smad4的表达明显弱于对照组 ,肝脏纤维间隔不同程度地减少、变窄或不完整 ,纤维化程度也有所减轻。结论反义Smad4基因能有效减少Smad4基因的表达 ,进而部分阻断TGF β信号传导系统 ,以阻止贮脂细胞的活化 ,减少细胞外基质的产生 ,从而减缓肝纤维化的发展。

SMAD同源物4抑癌基因在小鼠散发性结直肠癌模型中的作用

目的构建Apc^loxP/loxP+SMAD同源物4(Smad4)^loxP/loxP双转基因小鼠模拟人散发性结直肠癌,观察Smad4在结直肠癌发生发展中的作用。方法分别将Apctm1Tyj/J小鼠、Smad4tm2.1Cxd/J小鼠与C57BL/6J小鼠(均购自美国杰克逊实验室)杂交和回交转换遗传背景形成杂合子小鼠C57BL/6-ApcloxP/-/J(记为ApcloxP/-)、C57BL/6-Smad4loxP/-(记为Smad4loxP/-),将ApcloxP/-和Smad4loxP/-小鼠杂交建系并通过聚合酶链反应(PCR)筛选出Apc^loxP/loxP+Smad4loxP/loxP小鼠。通过小鼠结肠镜分别向Apc^loxP/loxP+Smad4loxP/loxP小鼠和C57BL/6J小鼠(各12只)结直肠黏膜下注射前期构建好慢病毒LentivirusCre-IRES-Luciferase,腹腔注射荧光素酶D(D-luciferase)后在小动物活体成像系统(IVIS)下成像并通过结肠镜动态观察成瘤情况。最后对小鼠瘤灶取材行苏木精-伊红(HE)染色观察其病理改变。组间比较采用t检验。结果成功培育出Apc^loxP/loxP+Smad4loxP/loxP双转基因小鼠22只。在LentivirusCre-IRES-Luciferase诱导下发生突变并形成散发性结直肠肿瘤病灶,经病理组织学证实为腺癌,可通过IVIS系统及小鼠结肠镜动态观察其情况,至12周末成瘤率33%(4/12),C57BL/6J小鼠未观察到瘤变。两组体重分别为(22.58±1.21)、(21.36±1.01)g,比较差异无统计学意义(t=0.892,P>0.05);日龄分别为(63±1)、(62±1)d,差异无统计学意义(t=0.121,P>0.05)。结论本研究构建的Apc^loxP/loxP+Smad4loxP/loxP双转基因小鼠结肠组织在LentivirusCre-IRES-Luciferase诱导下发生癌变,成功模拟人散发性结直肠癌的发生过程,证实Smad4抑癌基因的条件性敲除可促进结直肠癌的发生。

膀胱癌18q缺失做图与Smads蛋白表达分析

目的 研究 18号染色体短臂的杂合性缺失在膀胱癌发生发展中的作用 ,为早诊及定位克隆相关基因提供资料。方法 利用位于 18q上的 12个多态性微卫星位点进行缺失做图 ,并对此区域的抑癌基因Smad 2和Smad 4进行免疫组织化学分析。结果 84 2 % (32 / 38)的病例至少在 12个位点中的一个发生杂合性缺失 ,最小缺失区域跨越Smad 4基因。免疫组化结果显示 :Smad 2蛋白有2 1 1% (8/ 38)表达上调 ,34 2 % (13/ 38)表达下调 ;Smad 4蛋白有 6 8 4% (2 6 / 38)表达下调而仅 1例表达上调。结论 18号染色体短臂的缺失与膀胱癌变相关。位于 18号染色体短臂的两个候选抑癌基因Smad 2和Smad 4的异常表达 ,对于膀胱癌的发生、发展可能有着重要作用。

阻断TGF-β_1信号传导在减缓四氯化碳/乙醇诱导的小鼠肝细胞癌发展中的作用

目的 探讨反义Smad4RNA阻断转化生长因子 β1(TGF β1)信号传导系统及其对肝癌发生发展的影响。方法 采用逆转录病毒将反义Smad4基因导入四氯化碳 (CCl4) /乙醇诱导的小鼠肝脏 ,经Southern印迹证实反义Smad4基因已经整合入小鼠肝脏 ,Northern印迹及Western印迹方法显示反义Smad4基因能下调Smad4的表达。结果 发现纤维化肝脏Smad4的表达较正常组明显增强。经转基因处理后小鼠纤维化肝脏Smad4的表达明显弱于硬化组 ,且肝脏纤维化程度明显减轻。防治组和硬化组比较肝癌的发生率无明显差别 ,但防治组肝癌包块的直径、数目均不同程度地少于硬化组。结论 反义Smad4基因能有效阻断TGF β信号传导 ,从而减缓肝纤维化的程度 ;同时 ,能减缓肝癌的发展进程。