马氏珠母贝V-ATPase-d基因序列特征及其与耐低温性状的关系

液泡ATP酶(V-ATPase)在生物应对各种环境压力时发挥重要功能,为探究VATPase在马氏珠母贝低温适应过程中的作用,实验克隆了马氏珠母贝的V-ATPase-d基因,采用qRT-PCR技术研究了低温胁迫下Pm-V-ATPase-d表达量的变化,并筛选和比较了该基因在耐低温选育系(low temperature resistant line,R)F_(3)和北部湾野生群体(Beibu Gulf wild population,W)外显子区的SNP位点。结果显示,Pm-V-ATPase-d总长为1473 bp,开放阅读框(ORF)为1140bp,编码379个氨基酸,具有ATP典型的结构域PfamvATPsynt_AC39。Motif分析及三级结构预测结果表明,Pm-V-ATPase-d具有较高的保守性,其在系统进化树中与长牡蛎聚为一支。组织荧光定量结果显示,Pm-V-ATPase-d在所检测的组织中均有表达,在肝胰腺、性腺和鳃组织中表达量较高。在低温胁迫条件下,Pm-VATPase-d基因的表达量随着时间的延长呈现先上升后下降的趋势,且低温组的表达量在5 d内均显著高于对照组,这表明Pm-V-ATPase-d可能参与了马氏珠母贝对温度胁迫的响应;对Pm-V-ATPase-d外显子区的SNP分析共得到35个SNP,其中34个为同义突变,只有一个位点为非同义突变,26个SNP在W和R群体的不同基因型和等位基因之间具有显著差异,单倍型连锁不平衡分析结果显示,Pm-V-ATPase-d基因SNPs可形成6个单倍体块,14种单倍型,其中单倍型GAAT、CGC、TC、TG、AG与马氏珠母贝耐低温性状显著相关。研究表明,Pm-V-ATPase-d可能是参与调节马氏珠母贝低温适应过程中的候选基因,本研究可为马氏珠母贝对低温的适应机制提供研究基础,筛选出的与抗低温性状相关的SNPs及单倍型可应用于分子辅助育种。

朱砂叶螨V-ATP酶D亚基基因克隆与表达分析

【目的】旨在寻找防治朱砂叶螨有效的生物学办法。【方法】克隆出朱砂叶螨V-ATP酶D亚基(V-ATPase-D)基因,并对该基因进行了生物学特征分析;采用荧光定量PCR技术,对朱砂叶螨其生命周期中V-ATPase-D基因表达量进行了测定。【结果】克隆出朱砂叶螨V-ATPase-D(GenBank登录号:OR836605)。朱砂叶螨V-ATPase-D基因全长956 bp,开放阅读框744 bp,编码247个氨基酸,V-ATPase-D在朱砂叶螨的不同生长发育阶段均表现出了基因活性,其中在成螨期内展现出最高的表达水平,其次是卵阶段,而若螨与幼螨阶段则呈现出较低的基因表达水平。【结论】成功克隆出朱砂叶螨V-ATPase-D基因,并明确其在朱砂叶螨生长过程中不同时期内的基因表达活性,为进一步探索基因的作用机制同时也对以V-ATP酶为靶标的新型生物杀螨剂提供了研究基础。

掌叶木V-ATP酶C亚基基因克隆及表达模式分析

从珍稀濒危植物掌叶木中克隆了一个V-ATP酶C亚基(HbVATP_C)基因,对其生物信息学特征进行了分析,利用荧光定量技术检测了该基因在不同组织和干旱及盐胁迫下的表达模式。结果显示,该基因开放阅读框全长1128bp,编码375个氨基酸,蛋白分子量是42.57 kD,等电点为5.44,为亲水性蛋白。HbVATP_C具有典型的V-ATP_C结构域,与其他植物同源性较高。HbVATP_C在掌叶木根、茎和叶等不同组织中均有表达,在幼叶中表达水平显著高于其他部位。干旱胁迫下,该基因表达水平均高于对照,盐胁迫下变化不明显,说明该基因能响应干旱胁迫。为进一步研究该基因在掌叶木中的功能奠定了基础。

V(D)J重排酶RAG与转座子及转座子基因编辑工具的关系

V(D)J重排是高等脊椎动物产生特异性抗体和受体的基础事件,是适应性免疫的特征,其关键酶重组激活基因(RAG)及V(D)J重排如何起源是免疫学中的一个基础问题。多种证据表明RAG和V(D)J重排可能起源于转座事件。本文就V(D)J重排酶RAG的功能,及其和原始RAG转座子的关系进行论述,同时思考RAG转座子和转座子基因编辑工具的联系,旨在为新型基因编辑工具研发和利用提供参考。

利用基因扫描分析TCR Vβ亚家族的CDR3长度方法检测T细胞克隆性

分析了健康人、Ｔ－ＡＬＬ外周血及Ｔ细胞株Ｍｏｌｔ－４和Ｊｕｒｋａｔ中ＴＣＲＶβＴ细胞的表达和克隆性。应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＴＣＲＶβ２４个亚家族的ＣＤＲ３，并经基因扫描和序列分析确定Ｔ细胞克隆性。结果表明健康人表达除Ｖβ２０外的多克隆Ｔ细胞；Ｔ－ＡＬＬ仅表达３～４个Ｖβ亚家族Ｔ细胞；部分呈寡克隆性；Ｍｏｌｔ－４和Ｊｕｒｋａｔ分别表达Ｖβ２和Ｖβ８单克隆Ｔ细胞。Ｔ－ＡＬＬ中存在克隆性生长Ｔ细胞。该方法是检测Ｔ细胞克隆性的敏感和精确的方法。

AML-M1相关TCR Vβ克隆性增殖T细胞的研究

目的 了解急性髓细胞白血病M1亚型 (AML M1 )患者外周血TCRVβ亚家族T细胞的克隆性分布特点。 方法采用RT PCR扩增 9例M1患者外周血的单个核细胞的TCRVβ2 4个亚家族基因 ,分析其TCRVβ亚家族的利用情况。PCR产物进一步经基因扫描分析 ,了解其CDR3长度以判断T细胞的克隆性。结果 不同标本中可检测到 2～ 5个Vβ亚家族T细胞 ,以Vβ2、Vβ3、Vβ1 7和Vβ1 9为常见 ,并在Vβ2、Vβ3、Vβ5、Vβ8、Vβ9和Vβ1 9中发现克隆性生长T细胞。结论 M1病人外周血TCRVβ亚家族T细胞表达呈现明显的选择性和克隆性增殖情况 ,这可能与M1细胞相关抗原有关 ,且克隆性增殖Vβ亚家族分布以个体特异性为主。

McAb共激活T细胞介导肝癌细胞前后的膜分子与TCRVβ基因的表达

Ｔ淋巴细胞活化是一个涉及多种膜表面分子和受体以及一系列相关多肽的复杂过程，为了使Ｔ细胞发挥更好的识别和杀伤癌细胞的功能，采用抗ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８０（Ｂ７１）、ＣＤ２、ＣＤ５８ＭｃＡｂ分别刺激健康人ＰＢＬｓ后作用肝癌细胞，对作用前后ＰＢＬｓ用ＦＡＣＳ进行表型分析，结果发现：作用后ＣＤ３和ＣＤ８分子表达比作用前明显增高，而ＣＤ４分子无显著变化，同时基因家族采用ＲＴＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析ＴＣＲＶβ基因１～２０亚家族表达水平与特征，健康人ＰＢＬｓ分别加入ＩＬ２、ＰＨＡ、抗ＣＤ３和ＣＤ３＋ＣＤ２８、ＣＤ２８＋ＣＤ８０、ＣＤ２＋ＣＤ５８作用肝癌细胞（ＢＥＬ７４０２）前表达水平平均约为５％，作用ＢＥＬ７４０２后表达水平约为１３％～２５％，其特征为Ｖβ７增高，这提示在癌抗原的参与下ＭｃＡｂ共刺激的Ｔ细胞活化，ＴＣＲ接受ＡＰＣ相应抗原的刺激，具有该ＴＣＲ的淋巴细胞迅速增殖而成为针对抗原的Ｔ细胞克隆，发挥其识别和杀伤癌细胞的作用，这将为肿瘤生物治疗的研究提供分子免疫学依据。

NB4和HL-60细胞诱导的脐血T细胞TCR Vβ基因谱系分析

目的:了解经NB4细胞和HL-60细胞体外诱导后脐血T细胞的TCR Vβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况。方法:采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养(MLTC)方法,用经丝裂霉素灭活的NB4细胞和HL-60细胞体外诱导脐血T细胞增殖,利用RT-PCR分析经MLTC前后T细胞的24个TCR Vβ亚家族的利用情况,并用基因扫描分析其克隆性特点。结果:诱导前脐血T细胞表达20个TCR Vβ亚家族,诱导后的T细胞所表达的TCR Vβ亚家族随培养时间增加而逐渐减少,且诱导组呈现出克隆趋势或寡克隆增殖特点。两种细胞诱导后10 d均可见Vβ1的克隆增殖出现变化,此外,NB4诱导的T细胞出现Vβ15,而HL-60诱导的T细胞则出现Vβ23的克隆增殖情况。结论:NB4细胞和HL-60细胞可诱导脐血TCR VβT细胞克隆性增殖,此优势表达的克隆性T细胞可能与特异性抗原介导的细胞免疫反应有关。

抗原特异TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCRV β13-pIRES2-EGFP真核表达载体的构建及共转染研究

目的构建携带弥漫大B型非霍奇金淋巴瘤(DLBL)相关抗原特异性的TCR Vα和TCR Vβ基因片段的真核表达载体TCR Vα-pIRES2-EGFP和TCR Vβ-pIRES2-EGFP,将其共同转染Raji和Jurkat细胞。方法前期研究从1例DLBL患者外周血T细胞中发现克隆性增殖T细胞受体(TCR)Vα6和Vβ13亚家族T细胞,在此基础上利用RT-PCR扩增TCR Vα6和TCR Vβ13基因全长序列后,分别将其定向克隆入带有绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pIRES2-EGFP,酶切和核酸序列测定分析方法鉴定重组质粒TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP的正确性;利用核转染技术(nucleofector)将其分别或共同转染Raji细胞和Jurkat细胞,24 h后利用激光共聚焦显微镜观察EGFP的瞬时表达情况,48 h后利用实时定量PCR检测TCR Vα6和TCR Vβ13基因的表达情况,Western blot检测EGFP蛋白的表达情况。结果获得来自DLBL患者的TCR Vα6和TCR Vβ13基因全长序列,酶切分析和核酸序列测定证实TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP重组质粒构建正确;转染24 h后,激光共聚焦显微镜下可观察到EGFP的表达,40%以上细胞发出绿色荧光,单独转染和共转染组荧光产生情况相似;实时定量PCR在单独转染和共转染组均可检测到TCR Vα6和TCR Vβ13基因的表达,共转染组2基因的表达水平稍低于单独转染组;Western blot检测在单独转染和共转染组均显示EGFP蛋白的表达,2组的蛋白杂交带强度相似。结论成功构建了DLBL特异性的TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP真核表达质粒,两者可同时转染到细胞中,并实现了体外共表达。

急性早幼粒细胞白血病患者中TCR Vβ T细胞体内外克隆性增殖的比较

急性早幼粒细胞白血病 ;T细胞受体Vβ基因 ;T细胞培养 ;克隆性增殖为了解急性早幼粒细胞白血病 (APL)患者T细胞在体内或体外经诱导后TCRVβ亚家族的分布和克隆性增殖特点 ,利用T淋巴细胞液体培养法 ,在rhIL 2和抗CD3单抗条件下诱导扩增APL患者单个核细胞 ,并应用RT PCR分别扩增培养前后患者T细胞的TCRVβ 2 4个亚家族基因的互补决定区 3 (CDR3 )片段 ,了解各Vβ亚家族的表达情况 ;对阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度 ,了解T细胞克隆性。结果发现 ,APL患者T细胞仅表达部分Vβ亚家族 ,但经体外培养后可检测到部分新增TCRVβ亚家族T细胞。全部患者存在某些TCRVβ亚家族的克隆性增殖T细胞。 2例患者均出现相似的Vβ1,Vβ3 ,Vβ7,Vβ16和Vβ2 0T细胞的克隆性增殖情况。结论 :T细胞的体外培养可诱导某些Vβ亚家族的表达。在T细胞培养不同时间中 。

大鼠TCR Vβ8.2基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建含大鼠TCRVβ8.2基因的重组真核表达质粒,并检测其在体内外的表达。方法:以RTPCR法分离Lewis大鼠脾淋巴细胞中的TCRVβ8.2基因片段,插入到真核表达载体pTARGET中,构建重组表达载体pTARGETTCRVβ8.2,并转化E.coliJM109,经蓝白斑筛选阳性菌落,进行菌落PCR和测序鉴定。将重组质粒以肌注法免疫BALB/c小鼠,采集注射部位股四头肌处的肌肉,用RTPCR及免疫组化染色法检测TCRVβ8.2基因在注射部位的转录和表达。通过脂质体介导,将重组质粒导入COS7细胞中进行瞬时表达,用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达。结果:测序鉴定证实,TCRVβ8.2基因已被正确插入到pTARGET载体中,并检测到在肌肉组织和COS7细胞内重组蛋白的表达。结论:成功地构建重组真核表达质粒pTARGETTCRVβ8.2,并在体内体外均可检测到其转录和表达,为进一步进行TCRVβDNA疫苗的研究奠定了基础。

TCR Vβ2、Vβ5和Vβ17-Dβ1 sjTRECs在正常人胸腺、脐血和外周血中的检测情况

目的建立检测TCR Vβ2、Vβ5和Vβ17-Dβ1 sjTRECs的方法,分析其在胸腺细胞、脐血和正常人外周血T细胞中的存在情况,从而了解近期胸腺输出相应的TCR Vβ亚家族naive T细胞的情况。方法利用半巢式PCR分别扩增3例正常胸腺细胞1、0例脐血和10例正常人外周血单个核细胞DNA中的Vβ2、Vβ5和Vβ17与Dβ1基因片段重排时产生的sjTRECs。结果在正常胸腺细胞、脐血和正常人外周血单个核细胞中均可检测到Vβ2、Vβ5和Vβ17与Dβ1片段形成的sjTRECs,其中胸腺细胞和脐血单个核细胞DNA中3种删除环的检出率均为100%,正常人外周血3种删除环的检出率分别为50%、70%和40%。结论成功地建立检测3种V-βDβ1 sjTRECs的方法,并提供了Vβ2、Vβ5和Vβ17亚家族sjTRECs在胸腺、脐血和外周血中的检测情况。

HBsAg HBeAg作用PBLs对TCR Vβ基因表达的影响

目的探讨乙肝病毒（ＨＢＶ）与肝癌的相关性．方法取用乙肝疫苗注射３次前后外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）；ＨＢＶＤＮＡ转染的ＨｅｐＧ２２２１５株培养上清（ＨＢｓＡｇ，ＨＢｅＡｇ阳性）感染健康人ＰＢＬ后进行ＴＣＲＶβ基因１－２０亚家族表达水平的分析．结果乙肝疫苗注射后及ＨｅｐＧ２２２１５株培养上清感染健康人ＰＢＬ后ＴＣＲＶβ６，１４；Ｖβ６，１５特异性扩增而表达水平显著增高．结论Ｖβ６可能为识别ＨＢＶ抗原或引发免疫应答的基因片段，但Ｖβ１４，１５各自在限制和杀伤功能方面起着重要的作用。

白血病异基因造血干细胞移植后TCR Vβ亚家族基因谱的研究

目的 了解白血病病人异基因外周血干细胞移植后1年以上患者TCR VβT细胞免疫功能重建的情况。方法 采用 RT-PCR扩增5例CML和1例AML-M3a移植后（12-56个月）患者外周血的单个核细胞的 TCR Vβ 24个亚家族基因,分析其TCR Vβ亚家族的表达。结果 经24个 Vβ引物所分别进行的RT-PCR检测TCR Vβ各亚家族基因的表达情况,发现6例病人外周血与正常人表达24个Vβ亚家族有明显的不同,病人的部分Vβ亚家族T细胞仍未能重建,仅表达5-22个亚家族基因。结论 移植后1年以上患者尽管CD3+T细胞已恢复,但外周血TCR Vβ亚家族基因谱的表达仍不完全,T细胞免疫功能仍未完全重建。

CML细胞诱导自体和脐血T细胞TCR Vβ谱系和杀伤性分析

目的 了解慢性粒细胞白血病 (CML)细胞诱导T细胞的TCRVβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况 ,及其对CML细胞的杀伤活性。方法 采用混合淋巴细胞 肿瘤细胞培养 (MLTC)方法 ,利用CML细胞体外诱导脐血或患者的T细胞增殖 ,用RT PCR和基因扫描分析MLTC前后T细胞的 2 4个TCRVβ亚家族基因的互补决定区 (CDR3) ,了解各Vβ亚家族的利用和T细胞克隆性特点。并利用LDH方法检测MLTC后T细胞的细胞毒性。结果 脐血T细胞表达 8～ 11个TCRVβ亚家族 ,经MLTC后 ,2～ 3个Vβ亚家族呈克隆性增殖 ,CML细胞诱导的自体T细胞的TCRVβ亚家族也类似。经MLTC后T细胞对原诱导细胞有较强的杀伤活性。结论 CML细胞可诱导脐血T细胞和自体T细胞TCRVβ优势利用和克隆性增殖 ,诱导后T细胞具有特异性杀伤CML细胞的作用。

Hela细胞诱导下TCR Vβ基因的选择性表达与重排研究

目的研究Hela细胞诱导下T细胞受体(Tcell receptor,TCR)Vβ亚家族基因的优势表达规律,并探讨其是否与重排激活基因(RAGs)介导的TCR重排相关。方法将Hela细胞与健康人外周血单个核细胞(PBMC)混合培养,利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测共培养前后TCRVβ各亚家族基因、重排激活酶RAGs、非同源末端连接(non-homogousend joining,NHEJ)途径中的核心蛋白Ku70/Ku80及末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)等的表达特点。结果随着混合培养时间的推移,TCRVβ各亚家族基因由最初的全部表达逐渐转变为选择性的部分表达,其中,TCRVβ7在各时间段都有明显的表达;Ku70随着培养时间的推移表达量逐渐减少直至没有表达;而RAGs、ku80和TdT基因在各个时间段均未检测到其表达。结论在Hela细胞诱导下,TCRVβ各亚家族基因的表达有一定的选择性但无明显的特异性,该选择性表达可能与RAGs介导的二次重排无关。

独特型TCR Vβ2 DNA疫苗的构建和体外表达检测

目的:构建抗淋巴细胞白血病的独特型TCRVβ2DNA疫苗,并检测其转染K562细胞和体外表达情况。方法:利用RT-PCR扩增表达TCRVβ2的Molt-4细胞株的独特型TCRVβ2基因片段,定向克隆于pIREs表达载体中,重组质粒转染至K562细胞中,利用间接免疫荧光法、SDS-PAGE和Westernblotting等检测其表达情况。结果:经PCR检测证实成功构建pIREs-TCRVβ2重组子,转染至K562细胞后,利用Vβ2单抗可检测到K562细胞表面表达TCRVβ2,SDS-PAGE分离检测为15kD的蛋白质,并经Vβ2特异抗体Westernblotting鉴定为TCRVβ2蛋白。结论:成功构建pIREs-TCRVβ2DNA疫苗,并可以在K562细胞株中表达特异蛋白。

CD28与B7.1共刺激PBLs受肝癌细胞诱导后的TCR Vβ基因表达

目的研究T细胞受体(TCR)Vβ在外周血淋巴细胞(PBLs)中的表达。方法用单克隆抗体CD28+B7.1(CD80)共刺激正常人外周血淋巴细胞后作用于肝癌细胞(BEL-7402)。结果发现PBLsTCRVβ7基因在体外选择性扩增,表达水平为15%～25%,对照组为4%～8%。结论Vβ7基因对识别肿瘤抗原具有特异性,为肿瘤基因治疗和研究提供新的线索和实验依据。

再生障碍性贫血儿童TCRVβ亚家族T细胞克隆性增殖及其与HLA-DRB1*15的关系

【目的】探讨再生障碍性贫血(再障)儿童TCRVβ24个亚家族T细胞克隆性及其与HLA-DRB1*15的关系。【方法】再障儿童17例(SAA14例,MAA3例),采用RT-PCR和基因扫描分析外周血或骨髓TCRVβ24个亚家族基因的表达和克隆性,SSP-PCR检测HLA-DR。【结果】再障儿童外周血T细胞仅表达4～22个Vβ亚家族,而正常儿童外周血T细胞几乎表达所有Vβ亚家族。12例(包括初诊SAA4例,CR4例,复发1例和MAA3例)再障儿童存在不同程度T细胞克隆性增殖,但个体间差异较大,正常外周血和骨髓均为多克隆性T细胞。5例HLA-DRB1*15(+)患儿中4例(80%)有寡克隆T细胞,而12例HLA-DRB1*15(-)患儿中仅3例(25%)见寡克隆T细胞,两组比较差异具有显著意义(P<0.05)。伴寡克隆T细胞的6例SAA儿童经免疫抑制治疗后达CR;不伴寡克隆T细胞的5例SAA儿童接受免疫抑制治疗,其中CR1例,PR2例、无效1例,死亡1例。【结论】大多数再障儿童存在T细胞克隆性增殖,寡克隆T细胞多见于SAA,尤其是HLA-DRB1*15(+)的SAA儿童。TCRVβT细胞克隆的检测对进一步了解再障免疫功能状态、预测免疫抑制治疗效果具有一定的参考价值。

苯接触工人外周血T细胞受体TCRV_β亚家族基因多态性分析

目的 了解苯接触工人外周血TCRVβ 亚家族T细胞的分布及其克隆性 ,寻找防治苯中毒的免疫指标。方法 采用RT PCR扩增 6例不同工龄低浓度苯接触工人外周血单核细胞的TCRVβ2 4个亚家族的互补决定区 3(CDR3) ,产物进一步经基因扫描分析确定T细胞的克隆性 ,并与 8名健康人作对照。结果 8名健康者表达全部Vβ 亚家族 ,PCR产物呈多峰图像 (多克隆 )。苯接触工人随工龄不同 ,外周血损伤的情况不同而出现Vβ 表达减少 ,PCR产物出现寡克隆或双克隆改变。结论 低浓度苯接触工人的外周血T细胞的TCRVβ 亚家族表达出现限制性 ,部分Vβ 亚家族呈克隆性增殖 ,可能由于苯损害T细胞而造成机体免疫的不同改变。