野生和人工养殖暗纹东方鲀不同组织中河豚毒素(TTX)含量的初步研究

采用小鼠生物检测法测定了野生和人工养殖暗纹东方不同组织中河豚毒素（ＴＴＸ）的含量．野生暗纹东方不同组织中ＴＴＸ含量由高到低依次是：卵巢、肝脏、胃肠、肾脏，肌肉毒性最小；而人工养殖暗纹东方不同组织中ＴＴＸ含量都极低，几乎无毒．结果表明，用人工养殖方法可以培育出低毒或无毒河豚，在一定程度上支持了河豚毒素的微生物起源学说．

产河豚毒素微生物的研究进展

【背景】河豚毒素(TTX)是已知毒性较强的海洋毒素之一,广泛分布于河鲀等海洋生物体内。作为典型的钠离子通道阻断剂,TTX在镇痛、戒毒和抗心律失常等医疗领域展现出巨大的应用价值。然而,因获取困难和产量低下,TTX在医药领域的应用受到制约。因此,利用微生物发酵生产TTX成为了一个备受关注的研究方向。【目的】了解TTX的概况、产TTX微生物的分布和分类学多样性、TTX的发酵生产研究及TTX在微生物和环境中的迁移机制。【进展】目前,学界对TTX的理化性质已有较为清晰的认识,但其来源仍无明确定论。自1986年以来,科研人员陆续从河鲀、蓝环章鱼(Octopus maculosus)等生物及其栖息环境中分离出约150株产TTX菌株,其中以弧菌属、芽胞杆菌属为主,这些发现不仅为TTX的微生物起源说提供了强有力的理论支撑,也为后续利用微生物发酵生产TTX的研究奠定了坚实的基础。许多学者对TTX菌株发酵产毒中关键影响因素以及TTX迁移机制进行了探究,并取得了一定的成果。【展望】未来研究可重点考虑定向改造产TTX菌株、完善菌株大规模培养条件、探索影响菌株产TTX能力的关键因素以及分析微生物群落的相互作用对其合成TTX的影响,从而为TTX生物合成机制的阐明提供借鉴。【意义】通过对产TTX微生物的综述,阐明TTX的生物合成途径,为实现TTX规模化生产,解决TTX获取困难、成本高的难题,推动其在医药领域的应用提供理论参考。

河豚毒素(TTX)及其衍生物的电子结构和构效关系及与石房蛤毒素(STX)的比较研究

对河豚毒素(TTX)及其五个衍生物进行了量子化学计算,根据对其电子结构及相关分析研究结果,结合其空间结构特点,讨论了它们的活性部位、作用方式及构效关系,发现胍基是最重要的的正电中心,在与受体作用时发挥接受电子的重要作用;O(17),O(18),O(15),O(21),O(19)等氧原子是供电子的主要负电部位.对TTX与石房蛤毒素(STX)进行了电子结构和空间结构比较,发现它们具有相似的电子结构特征,而且主要活性部位在空间位置上基本相互对应.这表明钠离子通道阻断剂在与受体相互作用时具有共同的结构特征和作用方式,同时也为探讨受体结构提供了有价值的信息.

国产河豚毒素（TTX）单克隆抗体8A5有效地拮抗TTX对钠流的抑制

利用克隆系ＮＧ１０８－１５细胞在膜片箝全细胞（ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌｃｌａｍｐｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）记录下，观察了国产ＴＴＸ单克隆抗体８Ａ５拮抗ＴＴＸ对跨膜钠电流的作用。结果表明，８Ａ５有效地抑制ＴＴＸ的作用：（１）在标准灌流液中加入１μｍｏｌ／ＬＴＴＸ，Ｎａ＋流立即被完全阻断，复加１μｍｏｌ／Ｌ８Ａ５于灌流液，可使Ｎａ＋流迅速恢复至对照水平；（２）若先以含１μｍｏｌ／Ｌ８Ａ５的溶液灌流细胞，再更置为含１μｍｏｌ／ＬＴＴＸ的标准液，Ｎａ＋流只有部分被抑制。

河豚毒素(TTX)及其微生物起源

河豚毒素(TTX)是一种强毒性海洋生物活性物质,最初是从豚科鱼(Tetrodontidae)中发现.故1909年被Tahara命名为Tetrodotoxin(TTX).本文介绍了TTX的化学特性、毒性作用机制、药理作用、检测方法、在不同生物种中的分布、能产生TTX的微生物种类,以及在此基础上提出的TTX 微生物起源学说的国内外最近研究报道.并提出了TTX微生物起源学说的应用前景及今后的研究课题.

小鼠生物法和酶联免疫法(ELISA)定量监测沿海5省养殖河豚鱼中的河豚毒素(TTX)

为进一步扩大国内养殖河豚鱼消费市场提供依据,应用小鼠生物法监测了我国辽宁、河北、山东,江苏和福建4种养殖河豚鱼(红鳍东方鲀,菊黄东方鲀,双斑东方鲀和暗纹东方鲀4种组织(皮、肉、肝脏和性腺)中河豚毒素(TTX)含量及周年变化,并用酶联免疫法(ELISA)同步检测了山东红鳍东方鲀的皮,肉和肝脏各组及个别卵巢样品。结果4种养殖河豚鱼的皮,肉和肝脏每组平均含毒量均属无毒(小鼠生物法检测结果小于0.5μg/g,ELISA检测结果小于0.8μg/g)。卵巢发现一强毒例,精巢则全部无毒。通过监测,发现养殖河豚鱼组织器官的毒力呈现一定的周年变化。ELISA法与小鼠生物试验测得的结果相符合。养殖河豚鱼皮,肉和精巢认为可以考虑科学安全的利用,肝脏须谨慎对待,由于养殖河豚鱼上市规格较小,卵巢一般无食用意义,加工过程应注意不要污染可食部分。

暗纹东方鲀TTX的微量、快速检测

采用高效液相色谱法建立快速、微量检测河毒素方法。使用WaterspicoTagTMFAA色谱柱；以5％乙腈中含0．005N三氟乙酸和0．005N乙酸为流动相；荧光检测波长：激发波长为365nm，发射波长为510nm。该方法在25ng／ml～300ng／ml线性范围内峰面积响应值与其浓度呈良好的线性关系，r＝0．9994。最低检测线为1ng。该方法可简便、快速、微量、准确定性、定量检测河毒素。

TTX通过JAK2/STAT3通路活化SOD减轻心肌细胞凋亡

目的:研究JAK2/STAT3信号通路在河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)心脏停搏液心肌保护中的作用。方法:24只Wistar大鼠随机均分为对照组、TTX组和TTX+AG490组,每组8只。对照组:开胸取左心室肌作为缺血前对照。TTX组:建立离体心脏Langendorff-Neely灌注模型,预灌注K-H缓冲液30min后,灌注4℃TTX心脏停搏液,停搏心脏并低温维持60min,复灌K-H缓冲液60min后,取左心室肌备用。TTX+AG490组:操作同TTX组,但预灌和复灌时均在K-H缓冲液中加入JAK2抑制剂AG490(5μmol/L)。分别采用免疫组化法、比色法和TUNEL法测定心肌组织中p-STAT3、SOD活性和MDA含量,以及心肌细胞凋亡指数(Apoptosisindex,AI),并比较组间的变化。结果:与对照组相比,TTX组和TTX+AG490组p-STAT3表达量均明显增加(P<0.05);予以AG490处理后,p-STAT3表达量较TTX组明显下降(P<0.05)。与对照组相比,TTX组和TTX+AG490组SOD活性和MDA含量均明显增加(P<0.05);予以AG490处理后,SOD活性较TTX组显著降低(P<0.05),MDA含量却明显增加(P<0.05)。经历缺血再灌注后,TTX组和TTX+AG490组心肌细胞AI明显高于对照组(P<0.05);与TTX组相比,TTX+AG490组AI显著增加(P<0.05)。结论:JAK2/STAT3信号通路通过增强SOD活性,减轻膜脂质过氧化损伤,减少心肌细胞凋亡,介导TTX心脏停搏液对缺血心肌的保护作用。

JAK2/STAT3通过上调Bcl-2蛋白介导TTX心肌保护作用

目的:研究JAK2/STAT3信号通路在河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)心脏停搏液心肌保护中的作用。方法:24只Wistar大鼠随机分为对照组、TTX组和TTX+AG490组,每组8只。对照组:开胸取左心室肌作为缺血前对照。TTX组:建立离体心脏Langendorff-Neely灌注模型,预灌注K-H缓冲液30min后,灌注4℃TTX心脏停搏液,停搏心脏并低温维持60min,复灌K-H缓冲液60min后,取左心室肌备用。TTX+AG490组:操作同TTX组,但预灌和复灌时均在K-H缓冲液中加入JAK2抑制剂AG490(5μmol/L)。采用免疫组化法测定心肌组织中p-STAT3(磷酸化STAT3)和Bcl-2表达量(Protein expression index,PEI),TUNEL检测心肌细胞凋亡指数(Apoptosis index,AI),比较2组间的变化。结果:与对照组相比,TTX组和TTX+AG490组心肌组织中p-STAT3和Bcl-2的表达量均明显增加(P<0.05);予以AG490处理后,p-STAT3和Bcl-2的表达量较TTX组明显下降(P<0.05)。Bcl-2蛋白表达与p-STAT3蛋白表达呈正相关(r=0.743,P<0.05)。经历缺血再灌注后,TTX组和TTX+AG490组心肌细胞AI明显高于对照组(P<0.05);与TTX组相比,TTX+AG490组AI显著增加(P<0.05)。结论:JAK2/STAT3信号通路通过上调Bcl-2的表达,抑制心肌细胞凋亡,介导TTX心脏停搏液对缺血心肌的保护作用。

JAK2/STAT3通过上调HSP70蛋白介导TTX心肌保护作用

目的研究JAK2/STAT3信号通路在河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)心脏停搏液心肌保护中的作用。方法 24只Wistar大鼠随机均分为对照组、TTX组和TTX+AG 490组,每组8只。对照组:开胸取左心室肌作为缺血前对照。TTX组:建立离体心脏Langendorff-Neely灌注模型,预灌注K-H缓冲液30min后,灌注4℃TTX心脏停搏液,停搏心脏并低温维持60min,复灌K-H缓冲液60min后,取左心室肌备用。TTX+AG490组:操作同TTX组,但预灌和复灌时均在K-H缓冲液中加入JAK2抑制剂AG490(5μmol/L)。采用免疫组化法测定心肌组织中p-STAT3(磷酸化STAT3)和HSP 70表达量(protein expression index,PEI),TUNEL检测心肌细胞凋亡指数(apoptosis index,AI),比较组间的变化。结果与对照组相比,TTX组和TTX+AG490组心肌组织中p-STAT3和HSP 70的表达量均明显增加(P<0.05);予以AG490处理后,p-STAT3和HSP 70的表达量较TTX组明显下降(P<0.05)。HSP 70蛋白表达与p-STAT3蛋白表达呈正相关(r=0.826,P<0.05)。经历缺血再灌注后,TTX组和TTX+AG490组心肌细胞AI明显高于对照组(P<0.05);与TTX组相比,TTX+AG490组AI显著增加(P<0.05)。结论 JAK2/STAT3信号通路通过上调HSP 70的表达,调动心脏内源性保护机制,介导TTX心脏停搏液对缺血心肌的保护作用。

TTX停搏液对离体鼠心结蛋白作用及机制的研究

目的研究Na+通道阻滞剂河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)停搏液对离体鼠心结蛋白的作用及机制。方法20只Wistar大鼠随机分为实验组和对照组,建立离体鼠心Langendorff和Neely灌注模型,搏动稳定后,灌注30min后停搏60min,再复灌60min,观察各组心脏停搏前后心功能指标的变化,通过免疫组化检测钙蛋白酶、免疫组化和蛋白印迹(Western blotting,WB)检测结蛋白的分布及量的变化。结果复灌后,实验组的各项心功能恢复率明显优于对照组(P﹤0.01或P﹤0.05),钙蛋白酶分布整齐,表达量为0.07156±0.00005,明显低于对照组的0.14592±0.00003(P﹤0.01);结蛋白分布紊乱,表达量为574.1±4.7,明显高于对照组的383.5±8.6(P﹤0.01)。结论TTX停搏液对离体鼠心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI)时的结蛋白及心功能有保护作用,其机制可能是通过抑制钙蛋白酶的激活而引起的。

河豚毒素中和性单抗的制备、鉴定及TTX检测方法的建立

目的研制河豚毒素中和性单抗,建立基于河豚毒素单抗的河豚毒素检测方法。方法用TTX-KLH免疫Balb/c小鼠,用TTX-BSA间接ELISA筛选,建立杂交瘤细胞系,腹腔接种Balb/c小鼠诱生腹水,Protein A Sepharose CL4B亲和柱纯化,SDS-PAGE、间接ELISA鉴定;用常规法确定TTX对昆明小鼠的LD50;将单抗和TTX混合物注入小鼠腹腔,检测单抗对TTX的中和能力;建立检测TTX的竞争ELISA法。结果获得了2株TTX中和性单抗,腹水用Protein A Sepharose CL 4B纯化后抗体纯度大于95%;常规间接ELISA检测,显示单抗5E7的结合能力高于5E4。单抗对2 LD50 TTX攻击昆明小鼠的保护率为50%,建立了基于中和性单抗的TTX检测方法,TTX的最小检出浓度为1.56μg/mL。结论获得了TTX中和性单抗,对致死剂量TTX攻击昆明小鼠的保护率为50%,建立了基于中和性单抗的TTX检测方法,TTX的最小检出浓度为1.56μg/mL。

TTX停搏液对心肌α肌动蛋白的影响及机制研究

目的:研究Na+通道阻滞剂河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)停搏液对离体大鼠心肌α肌动蛋白(α-actin)的影响及其机制。方法:20只Wistar大鼠随机均分入St.Thomas-2停博组(STH-2组),TTX停博组(TTX组),建立离体心脏Langendorff和Neely灌注模型,搏动稳定后,灌注30min后停搏60min,再灌注60min,观察各组心脏停搏前后的心率(HR)、冠状动脉流量(CAF)、左心室收缩末期压力(LVESP)和压力变化速率(±dp/dt)的恢复率,采用免疫组化检测钙蛋白酶(Calpain),免疫组化和Westernblot检测α-actin的分布及量的变化。结果:恢复灌注后,TTX停搏组的各项心功能恢复率明显优于STH-2组(P<0.01,P<0.05),STH-2组的calpain分布紊乱,表达量明显增多(P<0.01);α-actin分布紊乱,表达量明显减少(P<0.01)。结论:以TTX阻断Na+通道为特点的心脏停搏液对大鼠心肌缺血-再灌注损伤(Myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI)时的α-actin及心功能的保护作用优于STH-2停搏液,其机制可能是直接或者间接的减少激活calpain引起的。

特异性Tetrodotoxin亲和吸附微珠的制备及其提取性能

将横纹东方豚卵巢与醋酸乙醇溶液混合匀浆,经离心,加热,沉淀,脱脂等处理,制得粗提液,活性炭吸附粗提液得到粗毒液;以壳聚糖为载体合成亲和微珠分别来分离纯化粗提液和粗毒液,用传统的小鼠生物法检测TTX毒素量.潮湿活性炭对TTX的吸附量约为2μg/g,潮湿亲和微珠吸附量约为10μg/g;亲和微珠吸附提取粗毒液,回收率达51%,直接吸附粗提液,回收率达到80%,同时蛋白也得到有效的去除.

两种织纹螺对TTX和PSP摄食转移的初步研究

织纹螺(Nassariusspp.)是沿海地区较常见的螺种之一,对其带毒途径现还存有分歧.本文选择厦门海域常见两种织纹螺,粗肋织纹螺(Nassarius nodiferus)和红带织纹螺(Nassarius succinctus)作为研究对象,以实验室生态环境下培养的塔玛亚历山大藻和月腹刺鲀内脏投喂织纹螺.采用美国分析化学家协会推荐的小白鼠的生物检测法,对织纹螺进行毒素检测.小白鼠生物检测结果表明,红带织纹螺本身不带毒性,而粗肋织纹螺本身带有毒性,麻痹性贝毒和河豚毒素两种毒素都可以通过摄食转移累积毒性.

芦根汁液救治小鼠TTX中毒试验观察

以标定的TTX提取液(1MU/mL)对ICR小鼠进行急性中毒试验,以芦根浸汁及煎汁腹注小鼠,观察其救治效果。结果表明,芦根煎汁的疗效较显著,而芦根、芦苇叶的浸汁也有一定疗效。

HPLC-柱后衍生荧光法测定水产品中河豚毒素含量结果的不确定度评定

通过建立HPLC-柱后衍生荧光法测定水产品中河豚毒素含量的不确定度评定方法,量化分析测定结果的不确定度分量,并对各分量相对贡献进行比较。结果表明:测定结果的不确定度主要来源于标准品的校准过程、样品称量、实验过程移取及定容、样品重复实验误差、前处理过程中的回收率不同等。其中校准不确定度中标准溶液配制的不确定度贡献最多,称样量不确定度最小;当水产品中河豚毒素的含量为90.6μg/kg时,其扩展不确定度为0.69μg/kg(包含因子k=2)。

河豚毒素对BV-2细胞氧化应激损伤的诱导作用

目的探究河豚毒素(TTX)暴露对小鼠小胶质细胞BV-2的氧化应激损伤的诱导作用。方法选择BV-2细胞进行TTX体外暴露。首先采用不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100μmol·L^(-1))TTX对BV-2细胞进行单独暴露,观察细胞形态和活力变化,利用CCK8法确定TTX联合暴露浓度。使用藜芦定(VTD)和毒毛旋花苷G(O)的混合物与TTX对BV-2细胞进行联合暴露,根据细胞形态和细胞活力验证BV-2细胞膜上离子通道类型。通过测定TTX单独暴露后乳酸脱氢酶(LDH)释放量、钙离子荧光量、活性氧(ROS)含量和细胞凋亡率水平,分析TTX暴露对BV-2细胞的影响。结果100μmol·L^(-1)TTX可改变BV-2细胞形态,抑制细胞活力。联合暴露情况下,TTX能够拮抗VTD和O混合物造成的细胞膜内外钠离子浓度差异,延缓细胞损伤状态。与对照组比较,100μmol·L^(-1)TTX可促使细胞膜通透性改变,释放4.01 U/g LDH。在100μmol·L^(-1)TTX暴露下分别升高细胞内钙离子和ROS水平,细胞相对荧光强度提升至84.78%和63.48%;100μmol·L^(-1)TTX暴露下,BV-2细胞凋亡率增加2.9倍。结论TTX暴露可以抑制BV-2细胞增殖能力,改变细胞膜的通透性,促使ROS在细胞内蓄积,诱导细胞氧化应激损伤,造成细胞凋亡。