保肺化纤方调控TGF-β1/smad2/3、Wnt1/β-catenin信号通路对BLM/PM2.5诱导的特发性肺纤维化大鼠肺组织胶原沉积的影响

目的探讨保肺化纤方经转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1/smad2/3、Wnt1/β-连环蛋白(catenin)信号通路减轻博来霉素(bleomycin,BLM)/PM2.5暴露诱导的特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)大鼠肺组织胶原沉积的作用机制。方法SD大鼠随机分为对照(Control)组、BLM+PM2.5(Model)组、保肺化纤方(BHF)组、吡非尼酮(pirfenidone,PFD)组、XAV-939组、BHF+PFD组、BHF+XAV-939组。采用一次性气管内雾化BLM法制备IPF大鼠模型,大气PM2.5实时浓缩全身暴露和给予相应药物干预。检测大鼠肺功能,观察肺组织病理和胶原沉积;采用免疫组化技术检测肺组织Ⅰ、Ⅳ型胶原(collagen,COL)、TGF-β1、smad2/3、β-catenin蛋白水平;采用qPCR技术检测肺组织TGF-β1、smad2/3、Wnt1、β-catenin mRNA水平。结果与Control组比较,Model组大鼠肺功能显著降低(P<0.01),肺组织可见大量炎症细胞浸润,肺泡壁断裂、增厚,胶原沉积等肺纤维化特征性病理改变,肺组织胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)、COLⅠ、COLⅣ蛋白及TGF-β1、smad2/3、β-catenin基因与蛋白表达均显著升高(P<0.01);与Model组比较,各治疗组均有效改善大鼠肺组织病理改变,显著降低肺组织CVF及COLⅠ、COLⅣ、TGF-β1、smad2/3、β-catenin蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),同时BHF组、BHF+PFD组、BHF+XAV-939组均能显著提高大鼠肺功能(P<0.05,P<0.01),明显下调肺组织TGF-β1、smad2/3、β-catenin基因表达水平(P<0.01);与PFD组比较,BHF+PFD组大鼠肺组织COLⅠ、TGF-β1蛋白及smad2、β-catenin基因表达均显著降低(P<0.05,P<0.01);与XAV-939组比较,BHF+XAV-939组smad3基因表达显著降低(P<0.01)。结论保肺化纤方可改善BLM/PM2.5诱导的IPF大鼠肺组织病理损伤,减少胶原沉积,提高肺功能,改善肺纤维化,其机制可能与下调TGF-β1/smad2/3、Wnt1/β-catenin通路有关。

HOXC6通过激活SFRP1/Wnt/β-catenin信号通路促进前列腺癌进展的机制研究

目的:探讨同源盒家族中的人类同源盒C6(HOXC6)基因在前列腺癌中的表达情况及其对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及机制。方法:应用基于基因表达水平值的交互式分析平台(GEPIA)数据库中关于HOXC6研究的数据,对其在前列腺癌中的表达水平变化进行分析。采用GEPIA数据库分析HOXC6表达水平与前列腺癌患者生存预后之间的关系。通过Western印迹检测HOXC6蛋白在前列腺癌组织、正常前列腺组织及不同前列腺癌细胞株DU-145、PC-3以及正常人前列腺上皮细胞RWPE-1中的表达情况。在人前列腺癌细胞DU145、PC-3和正常人前列腺上皮细胞RWPE-1中,利用siRNA质粒稳定干扰HOXC6基因表达,采用CCK8、平板克隆、划痕、Transwell侵袭实验检测HOXC6基因对前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。通过GEPIA数据库分析Wnt抑癌因子分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)基因与HOXC6的相关性,采用Western印迹检测HOXC6-siRNA转染后PC-3细胞中HOXC6、SFRP1、Wnt及β-catenin蛋白表达。结果:HOXC6在前列腺癌组织中的表达高于正常前列腺组织(P<0.01),在前列腺癌细胞中的表达高于正常前列腺上皮细胞(P<0.01)。结合生物信息学分析,HOXC6高表达的PCa患者比低表达的生存率低(P=0.011)。siRNA组HOXC6蛋白相对表达量、吸光度值、克隆形成数、侵袭细胞数低于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。通过GEPIA数据库发现SFRP1高表达的前列腺癌患者预后较好,在体外实验中,前列腺癌PC-3细胞系中,Western印迹分析Wnt及β-catenin蛋白的表达均上升,SFRP1蛋白表达明显下降(P<0.05);与siRNA-NC、前列腺癌PC-3相比,siRNA-HOXC6转染组中的Wnt及β-catenin蛋白的表达均明显下降,SFRP1蛋白表达上升(P<0.05)。结论:HOXC6在前列腺癌组织中高表达,并与前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭有关;HOXC6通过抑制SFRP1/Wnt/β-catenin信号通路从而促进前列腺癌DU145、PC-3细胞的生长,HOXC6有可能是临床治疗前列腺癌的潜在靶标。

Wnt1-Cre和Pax2-Cre标记的小鼠第一鳃弓颅颌面部神经嵴细胞异质性研究

目的利用Wnt1-Cre和Pax2-Cre小鼠特异性标记颅颌面神经嵴细胞(CNCs)迁移到第一鳃弓时的分化异质性及机制。方法分别收取胚胎期(E)8.0~E9.25Wnt1-Cre;R26R^(mTmG)及Pax2-Cre;R26R^(mTmG)小鼠胚胎进行整体荧光观察,利用石蜡切片免疫荧光对E15.5的Pax2-Cre;R26R^(Ai9)和Wnt1-Cre;R26R^(Ai9)小鼠所标记的CNCs在颅面部主要组织器官中的谱系分化情况进行比较分析,最后对E10.5的Wnt1-Cre;R26R^(mTmG)和Pax2-Cre;R26R^(mTmG)小鼠的第一鳃弓组织中CNCs进行单细胞测序分析,并对差异基因进行荧光定量聚合酶链反应(q-PCR)验证。结果Pax2-Cre和Wnt1-Cre小鼠特异性标记的CNCs均在E8.0自神经板开始迁移,但Pax2-Cre小鼠仅标记迁移到第一鳃弓的CNCs,而Wnt1-Cre同时标记了迁移到第一和第二鳃弓的CNCs;在分化谱系示踪方面,二者皆标记了CNCs分化形成的颅颌面部组织器官的间充质,但Wnt1-Cre在上腭和舌中标记CNCs更多;在第一鳃弓间充质中,Pax2-Cre所标记的CNCs特异性表达基因主要参与了成骨,而Wnt1-Cre所标记的CNCs特异性表达基因主要参与了肢体发育、细胞迁移和成骨,q-PCR结果也证实了两者高表达差异基因参与了以上功能。结论本研究结果提示Pax2-Cre小鼠可特异性用于第一鳃弓CNCs及其衍生组织成骨方面的研究。

非小细胞肺癌组织LncRNA MIR503HG、Wnt1表达与患者术后5年内生存的相关性

目的 探究非小细胞肺癌(NSCLC)组织中长链非编码RNA(LncRNA)miR503宿主基因(MIR503HG)、Wnt1表达水平与患者术后5年内生存的关系。方法 纳入108例NSCLC患者,并于术中收集患者肺癌组织和癌旁组织。荧光定量PCR法检测肺癌及癌旁组织中LncRNA MIR503HG、Wnt1 mRNA表达水平;免疫组织化学染色检测肺癌及癌旁组织中Wnt1蛋白表达。对NSCLC患者术后随访5年,记录随访期内生存状况。比较癌旁组织、肺癌组织中LncRNA MIR503HG、Wnt1 mRNA和蛋白阳性表达情况;比较不同结局NSCLC患者肺癌组织中两者表达水平及其在不同临床病理特征中的差异;Pearson法分析肺癌组织中两者表达水平的相关性;Kaplan-Meier生存曲线分析肺癌组织中两者表达水平与患者术后5年内生存的关系;多因素Cox回归分析NSCLC患者术后5年内生存的影响因素;受试者工作特征(ROC)曲线评估肺癌组织LncRNA MIR503HG、Wnt1 mRNA表达水平对患者术后5年内生存的预测价值。结果 肺癌组织中LncRNA MIR503HG表达水平低于癌旁组织,Wnt1 mRNA表达水平和Wnt1蛋白阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05)。低分化、TNM分期Ⅲ期、有淋巴结转移NSCLC患者肺癌组织LncRNA MIR503HG表达水平分别低于中高分化、TNM分期Ⅰ—Ⅱ期、无淋巴结转移NSCLC患者;Wnt1 mRNA表达水平分别高于中高分化、TNM分期Ⅰ—Ⅱ期、无淋巴结转移NSCLC患者(P<0.05)。肺癌组织中LncRNA MIR503HG与Wnt1 mRNA表达水平呈负相关(P<0.05)。108例NSCLC患者术后随访5年,生存48例(生存组),死亡60例(死亡组);LncRNA MIR503HG高表达组、Wnt1 mRNA低表达组术后5年累积生存率分别高于LncRNA MIR503HG低表达组和Wnt1 mRNA高表达组(P<0.05)。与生存组相比,死亡组肺癌组织LncRNA MIR503HG表达水平降低,Wnt1 mRNA表达水平升高(P<0.05)。肺癌组织LncRNA MIR503HG低表达、Wnt1 mRNA高表达、低分化、TNM分期为Ⅲ期、有淋巴结转移均是影响NSCLC患者术后5年内生存的独立危险因素(P<0.05)。肺癌组织LncRNA MIR503HG、Wnt1 mRNA及二者联合预测NSCLC患者术后5年内生存的曲线下面积(AUC)分别为0.823、0.728和0.885,联合预测效能更高(P<0.05)。结论NSCLC患者肺癌组织中LncRNA MIR503HG呈低表达,Wnt1呈高表达,二者与患者临床病理特征和术后5年内生存情况密切相关,对患者术后5年内生存情况有较高预测价值。

下调miR-208a通过靶向SFRP1介导Wnt信号通路对结直肠癌细胞5-FU耐药的改善作用

目的:探讨下调微小RNA-208a(miR-208a)对结直肠癌细胞5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药的影响,阐明其相关分子机制。方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测结直肠癌5-FU耐药细胞株HT-29/5-FU及其亲本HT-29细胞中miR-208a和分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)mRNA表达水平。以HT-29/5-FU细胞为研究对象,将miR-208a抑制物(miR-208a inhibitor)质粒及其阴性对照质粒(inbibitor-NC)和SFRP1小干扰质粒(si-SFRP1)及其阴性对照质粒(si-NC)分别或同时转染至HT-29/5-FU细胞中,联合5-FU处理,将细胞分为空白组、inhibitor-NC组、miR-208a inhibitor组、miR-208a inhibitor+si-NC组和miR-208a inhibitor+si-SFRP1组。MTT法检测各组细胞增殖活性并计算耐药指数,AnnexinⅤ-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测不同浓度5-FU作用后各组细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中SFRP1、β-连环蛋白(β-catenin)、P-糖蛋白(P-gp)和ATP结合盒B亚家族成员1转运蛋白(ABCB1)蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-208a与SFRP1的靶向关系。结果:与HT-29细胞比较,HT-29/5-FU细胞中miR-208a表达水平升高(P<0.05),SFRP1 mRNA表达水平降低(P<0.05)。与inhibitor-NC组比较,miR-208a inhibitor组细胞增殖活性降低(P<0.05),耐药指数降低,细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中β-catenin、P-gp和ABCB1蛋白表达水平降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验提示SFRP1是miR-208a靶基因,且miR-208a可负向调控SFRP1的表达。与miR-208a inhibitor+si-NC组比较,miR-208a inhibitor+si-SFRP1组细胞增殖活性升高(P<0.05),耐药指数升高,细胞凋亡率降低(P<0.05),细胞中β-catenin、P-gp和ABCB1蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:下调miR-208a可通过靶向上调SFRP1表达抑制Wnt信号通路的转导,进而改善HT-29/5-FU细胞对5-FU的耐药。

Sfrp-1通过下调Wnt信号对血管紧张素Ⅱ相关心肌损伤的影响

目的观察分泌型卷曲相关蛋白1(Sfrp1)调控无翼相关整合位点(Wnt)信号通路对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的体外心肌细胞损伤的影响。方法:体外培养大鼠心肌细胞H9c2,设置空白对照组(control组)、9型腺相关病毒载体组(aav9-Sfrp1组)和无Sfrp1基因组(aav9-NC组);control组仅进行常规培养,aav9-Sfrp1组和aav9-NC细胞分别转染aav9-Sfrp1和aav9-NC后,使用AngⅡ诱导心肌肥大模型。采用细胞计数试剂盒-8检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫荧光对心肌细胞内LC3进行染色,蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白(Sfrp1、p62、atg5、Beclin1、LC3)和Wnt/β-catenin通路相关蛋白(β-catenin、Dvl-1、Wisp1)表达。结果:aav9-Sfrp1组Sfrp1 mRNA表达水平高于aav9-NC组(P<0.01)。aav9-NC组细胞存活率低于control组,aav9-Sfrp1组细胞存活率高于aav9-NC组(P<0.01)。aav9-NC组细胞凋亡率高于control组,aav9-Sfrp1组细胞凋亡率低于aav9-NC组(P<0.01)。aav9-NC组LC3荧光染色强度低于control组,aav9-Sfrp1组LC3荧光染色强度高于aav9-NC组。aav9-NC组p62、LC3Ⅰ/Ⅱ表达高于control组,atg5、Beclin1表达低于control组(P<0.05);aav9-Sfrp1组p62、LC3Ⅰ/Ⅱ表达低于aav9-NC组,atg5、Beclin1表达高于aav9-NC组(P<0.01)。aav9-NC组β-catenin、Dvl-1和Wisp1表达高于control组(P<0.001),aav9-Sfrp1组β-catenin、Dvl-1和Wisp1表达低于aav9-NC组(P<0.001)。结论:Sfrp1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,诱导细胞自噬,减轻心肌肥大,发挥保护心肌损伤的作用。

BZW1高表达促进胃癌细胞的侵袭和转移:基于调控Wnt//β-catenin通路和促进上皮间质转化

目的明确碱性亮氨酸拉链蛋白1(BZW1)在胃癌中的表达情况,并探讨其对胃癌患者预后的影响及其可能的作用机制。方法分别采用TIMER、UALCAN和Kaplan-Meier Plotter数据库分析BZW1在胃癌组织中的表达情况,与肿瘤分级、分期之间的相关性及对患者预后的影响。纳入2014年1月~2016年12月在我院行胃癌根治术的102例患者,分析BZW1在胃癌组织中的表达水平、对胃癌疾病进展和患者术后5年生存率的影响。体外采用慢病毒转染的方式构建上调和下调BZW1表达的胃癌细胞系(MGC803),分析BZW1对MGC803细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化(EMT)的作用。采用KEGG富集分析预测BZW1在胃癌中的可能作用机制,并进一步采用Western blot实验进行体外验证。结果生物信息学分析结果显示,BZW1在胃癌和癌旁组织中的表达量差异有统计学意义(P<0.01),免疫组化和RT-qPCR结果显示,BZW1在胃癌组织中的蛋白和mRNA表达水平分别是癌旁组织的3.30倍和6.54倍(P<0.01);胃癌组织中BZW1的表达水平与外周血CEA和CA199水平呈正相关(P<0.01);单因素结合Cox多元回归模型分析证实BZW1高表达(P<0.05,HR=2.070,95%CI:1.021~4.196)是影响胃癌患者根治术后5年生存率的独立危险因素;以BZW1相对表达量3.61为截点值,预判术后5年死亡的敏感性为75.56%,特异性为71.93%(P<0.01)。Transwell实验显示,上调BZW1可促进MGC803细胞的迁移和侵袭(P<0.05),下调则相反(P<0.05)。Western blot实验发现,上调BZW1可促进MGC803细胞N-cadherin与Vimentin的表达(P<0.05),并抑制E-cadherin的表达(P<0.05),下调则反之(P<0.05)。富集分析显示,BZW1生物功能可能与Wnt//β-catenin信号相关。Western blot实验进一步证实,上调BZW1可促进Wnt3a、β-Catenin及C-myc的表达(P<0.05),而下调则相反(P<0.05);使用Wnt通路抑制剂XAV-939可显著削弱上调BZW1对MGC803细胞中EMT关键分子的蛋白N-cadherin、Vimentin及E-cadherin的调控作用(P<0.05)。结论BZW1在胃癌组织中高表达并影响患者预后,可能与调控Wnt/β-catenin信号促进胃癌细胞EMT进程相关。

三氧化二砷通过降低Pin1表达及调节Wnt/β-连环素通路抑制肝癌细胞增殖

目的探讨三氧化二砷(ATO)在肝癌中对肽基脯氨酰基顺反异构酶NIMA相互作用蛋白1(Pin1)表达的抑制作用及其分子机制。方法使用DepMap数据库和GEPIA数据库中的数据分析Pin1在人肝癌细胞系和肝癌组织中的表达情况。以人肝癌细胞系Huh7和小鼠肝癌细胞系H22为细胞模型,通过ATP法检测ATO对肿瘤细胞活力的影响;通过蛋白质印迹法、免疫荧光染色和qPCR检测ATO对Pin1在蛋白质水平和转录水平表达的作用。用氯喹预处理Huh7细胞抑制溶酶体途径后,通过蛋白质印迹法和免疫荧光染色检测ATO对Pin1表达的调控作用。通过皮下荷瘤小鼠模型和免疫组织化学染色验证ATO在体内对肝癌细胞生长和Pin1表达的影响。采用RNA测序分析ATO可能影响的信号通路,并通过蛋白质印迹法和qPCR验证。结果在DepMap数据库23种人肝癌细胞系和GEPIA数据库人肝癌组织中,Pin1的表达均呈现较高水平。在体外实验中,ATO处理后Huh7和H22细胞的细胞活力均降低,细胞中Pin1在蛋白质和转录水平的表达均降低,但用氯喹抑制溶酶体途径逆转了ATO对Pin1表达的影响。在皮下荷瘤小鼠模型中,ATO表现出一定的抗肿瘤效果,免疫组织化学染色显示ATO处理后Pin1表达和肿瘤细胞增殖受到抑制。在ATO处理的H22细胞中Wnt/β-连环素通路相关基因富集,抑制H22细胞中Pin1的表达后β-连环素表达减少。结论ATO通过溶酶体途径抑制Pin1表达,以及影响Wnt/β-连环素信号通路来抑制肝癌细胞增殖。

LEF1-AS1通过Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞迁移侵袭的影响

目的探讨淋巴增强结合因子1反义RNA 1(LEF1-AS1)通过调控Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法实时荧光定量PCR(qPCR)检测胃癌细胞和正常胃黏膜细胞GES-1中LEF1-AS1的表达情况。BGC-823细胞分为阴性对照组、LEF1-AS1干扰组和LEF1-AS1干扰+Wnt激动剂组。CCK-8法检测细胞活力,划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;qPCR和Western blot检测Wnt1、β-catenin和Survivin表达。结果LEF1-AS1在胃癌细胞中的相对表达量高于GES-1细胞(P<0.05)。与阴性对照组比较,LEF1-AS1干扰组BGC-823细胞的增殖和迁移侵袭能力均下降(P<0.05)。LEF1-AS1干扰组Wnt1和β-catenin表达水平低于阴性对照组(P<0.05)。LEF1-AS1干扰+Wnt激动剂组BGC-823细胞的增殖和迁移侵袭能力均强于LEF1-AS1干扰组(P<0.05),且β-catenin和Survivin水平较LEF1-AS1干扰组升高(P<0.05)。结论LEF1-AS1沉默通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活化来负调控胃癌细胞的生物学行为,该因子有作为胃癌治疗靶点的潜能。

血清胸苷激酶1、细胞角质蛋白19片段抗原21-1及dickkopfWNT信号通路抑制剂1对食管癌的诊断价值

目的探讨血清胸苷激酶1(TK1)、细胞角质蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)及dickkopf WNT信号通路抑制剂1(DKK1)对食管癌的诊断价值。方法选取62例食管癌患者作为食管癌组,59例健康体检者作为对照组。对比两组受试者TK1、CYFRA21-1、DKK1水平,对比不同分期食管癌患者TK1、CYFRA21-1、DKK1水平,分析TK1、CYFRA21-1、DKK1单独及联合检测对食管癌的诊断价值。结果食管癌组患者TK1、CYFRA21-1、DKK1水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。Ⅲ~Ⅳ期食管癌患者TK1、CYFRA21-1、DKK1水平均明显高于Ⅰ~Ⅱ期患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。TK1+CYFRA21-1+DKK1联合检测诊断食管癌的灵敏度和特异度分别为88.50%、79.10%,曲线下面积为0.779(95%CI:0.695~0.864),均高于三者单独检测。结论TK1、CYFRA21-1、DKK1联合检测有利于提高食管癌的诊断效能,防止误诊漏诊,三者对其病情评估具有一定参考价值。

IFIT1通过激活Wnt/β-catenin通路促进胆管癌进展

目的:探讨干扰素诱导的三十四肽重复蛋白1(IFIT1)对胆管癌进展的影响及其调控机制。方法:RT-qPCR和Western blot法分别测定人正常胆管上皮细胞系HIBEpiC和6种不同分化程度胆管癌细胞系中IFIT1的mRNA和蛋白表达水平;检测人胆管癌和癌旁组织中IFIT1的表达水平,分析其与临床病理特征的相关性及预后价值。采用CCK-8、平板集落和Transwell实验检测IFIT1下调对胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响;选用胆管癌细胞系HuCCT1构建IFIT1稳定敲减的细胞株,分别采用裸鼠皮下移植瘤及肺转移瘤模型,观察IFIT1对胆管癌生长及转移的影响。通过公共数据库基因富集分析富集于IFIT1的相关信号通路,并进行验证。结果:相对于正常胆管上皮细胞和低侵袭性的胆管癌细胞系,高侵袭性的胆管癌细胞系中IFIT1呈高表达;人胆管癌组织中IFIT1表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01),且与肿瘤恶性特征(肿瘤大小、淋巴结转移和肿瘤TNM分期)呈正相关,肿瘤组织中IFIT1高表达的患者总生存期相对较短(P<0.01)。IFIT1下调显著抑制胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在皮下移植瘤模型中,敲减IFIT1后皮下移植瘤生长速度减慢,体积缩小,重量减轻(P<0.01);在尾静脉肺转移瘤模型中,敲减IFIT1可显著减少裸鼠肺表面转移瘤结节数目(P<0.01)。生物信息学分析提示,与上皮-间充质转化(EMT)相关的Wnt/β-catenin通路在IFIT1高表达组富集。胆管癌细胞中敲减IFIT1可抑制Wnt/β-catenin通路,且EMT标志物vi⁃mentin和Snail表达减少。结论:IFIT1通过激活Wnt/β-catenin通路增强胆管癌细胞EMT,从而促进肿瘤进展。

苓桂术甘汤对心梗后慢性心衰模型大鼠心肌纤维化及心肌组织Wnt1/β-catenin信号通路蛋白表达的影响

目的:观察苓桂术甘汤对心肌梗死后慢性心衰大鼠心肌纤维化及心肌组织Wnt/β-catenin通路相关分子表达的影响,探讨其抑制心肌纤维化的作用和可能机制。方法:采用冠状动脉左前降支结扎法复制心肌梗死后慢性心衰大鼠模型;造模24 h后,连续干预4 w。采用小动物彩色多普勒超声成像系统检测大鼠LVIDd、LVIDs、LVEF、LVFS;HE及Masson染色观察大鼠心肌组织病理学变化;ELISA法检测大鼠血清CK-MB、cTnT及心肌组织CollagenⅠ、CollagenⅢ水平;Western Blot检测大鼠心肌组织Wnt1、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、α-SMA及细胞核β-catenin蛋白表达;RT-qPCR检测大鼠心肌组织β-catenin、MMP-9 mRNA表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠LVIDd、LVIDs水平显著升高,LVEF、LVFS水平显著降低(P<0.01),心肌组织出现明显的心肌细胞排列紊乱,心肌纤维部分断裂及间质纤维化等病理变化,血清CK-MB、cTnT和心肌组织CollagenⅠ、CollagenⅢ含量及CollagenⅠ/CollagenⅢ比值显著升高,心肌组织细胞质GSK-3β蛋白表达显著降低,心肌组织α-SMA蛋白及细胞质Wnt1、β-catenin、p-GSK-3β蛋白和细胞核β-catenin表达显著升高,心肌组织β-catenin、MMP-9 mRNA表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,苓桂术甘汤干预4 w后,上述指标均显著改善(P<0.05或P<0.01)。结论:苓桂术甘汤能减轻心肌梗死后慢性心衰大鼠心肌损伤并抑制心肌纤维化,改善CHF大鼠心功能,其作用机制与其抑制心肌组织Wnt/β-catenin信号通路激活有关。

多发性骨髓瘤患者的血清PINP、DKK1和SFRP3水平及其临床意义

目的探讨多发性骨髓瘤(MM)患者的血清I型原胶原氨基端前肽(PINP)、dickkopf Wnt信号通路抑制因子1(DKK1)和分泌型卷曲相关蛋白3(SFRP3)水平及其临床意义。方法纳入150例MM患者(MM组)及150健康体检者(对照组)。比较两组研究对象之间、不同临床分期MM患者之间、不同临床疗效MM患者之间的血清DKK1、PINP、SFRP3水平。采用Logistic回归模型分析治疗前血清DKK1、PINP和SFRP3水平与MM患者临床疗效的关系。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析治疗前血清DKK1、PINP和SFRP3水平对MM患者临床疗效的预测效能。结果MM组患者治疗前血清DKK1、PINP和SFRP3水平高于对照组(P<0.05);Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期MM患者治疗前血清DKK1、PINP、SFRP3水平依次升高(P<0.05);有效组患者治疗前血清DKK1、PINP、SFRP3水平低于无效组(P<0.05)。治疗前血清DKK1、SFRP3、PINP水平升高是影响MM患者临床疗效的独立危险因素(P<0.05)。治疗前血清DKK1和SFRP3水平对MM患者临床疗效无预测价值(曲线下面积<0.5,P>0.05),而治疗前血清PINP水平对MM患者的临床疗效有一定的预测价值(曲线下面积=0.663,P<0.05)。结论MM患者治疗前的血清DKK1、PINP和SFRP3水平高于健康人群,且与疾病严重程度有关,是MM患者临床疗效的影响因素。治疗前血清PINP水平对预测MM患者的临床疗效有一定的价值。

SRPK1激活Wnt/β-catenin通路促进肝癌细胞上皮间充质转化

目的 探讨丝氨酸精氨酸蛋白激酶1(SRPK1)对肝癌细胞株HepG2上皮间充质转化(EMT)的作用。方法 通过Ualcan及TIMER 2.0数据库分析SRPK1 mRNA在肝细胞癌(LIHC)与正常样本、配对癌旁样本之间的表达差异,与生存时间、临床分期、病理分期、TP53变异、人种、性别、年龄、体重等临床资料的关系。用HPA数据库的免疫组化数据验证SRPK1蛋白在LIHC组织及正常对照间的表达差异。构建SRPK1过表达及抑表达的HepG2细胞,并根据SRPK1表达差异分为SRPK1组及对照的Vector组,shRNA组及对照的Scramble组。Western blot检测4组细胞株SRPK1的蛋白水平。Western Blot、免疫荧光检测EMT分子标记物E-cadherin、Vimentin蛋白表达差异。核浆蛋白分离比较细胞β-catenin入核程度的变化。GEPIA2数据库分析在LIHC组织中SRPK1与Wnt/β-catenin通路下游基因Twist、MYC、MMP9的相关性,Real-time PCR验证SRPK1对Twist、MYC、MMP 9表达的影响。结果 SRPK1表达在LIHC组织中表达显著高于正常对照及配对癌旁样本(P<0.05),随疾病分期及病理分级增加而增加(P<0.05),高表达SRPK1组总生存期低于低表达组(P=0.035),LIHC患者TP53突变组SRPK1表达高于非突变组(P<0.05),在不同种族、性别、年龄、体重间无差别(P>0.05)。SRPK1过表达HepG2细胞E-cadherin表达下降,Vimentin表达增加(P<0.05);抑表达细胞E-cadherin增加,Vimentin下降(P<0.05)。SRPK1在LIHC组织中分别与Twist、MYC、MMP9表达呈正相关性(P<0.05);SRPK1过表达细胞β-catenin蛋白在细胞核中表达增加(P<0.05),Twist、MYC、MMP9表达增加(P<0.05);反之,抑表达细胞β-catenin在细胞核中表达下降(P<0.05),Twist、MYC、MMP9表达减少(P<0.05)。结论 SRPK1可能通过Wnt/β-catenin通路促进HepG2细胞EMT活化。

转录因子Foxq1通过WNT/β-catenin信号通路影响绒山羊毛囊干细胞增殖的研究

旨在探究陕北白绒山羊毛囊诱导期(E 66)和分化期(E 120)皮肤组织差异表达基因Foxq 1在绒山羊毛囊干细胞(HFSCs)中的功能。本研究选择年龄、体重基本一致的6只健康妊娠陕北白绒山羊母羊,在胚胎期E 66(n=3)和E 120(n=3)分别采集胎儿背部皮肤组织。将pAd-Foxq1和pAd-Blank过表达腺病毒分别侵染HFSCs,利用EdU、MTT及流式细胞等方法检测Foxq 1对HFSCs增殖的影响;利用qPCR和免疫荧光试验检测Wnt信号通路激活的标记因子CTNNB 1及Wnt信号通路下游基因的表达情况。qPCR结果表明,Foxq 1在绒山羊E 66和E 120皮肤组织差异表达(P<0.001),与测序数据一致;荧光显微镜下观察到彗星尾状荧光出现,表明Foxq 1腺病毒包装成功,且qPCR结果显示Foxq 1的过表达效率高达40000多倍(P<0.0001)。EdU和MTT结果表明,过表达Foxq 1后,毛囊干细胞的活力显著增强(P<0.05),EdU阳性细胞数量显著升高(P<0.01)。流式细胞周期结果显示,过表达Foxq 1后S期细胞比率显著升高。qPCR结果表明,过表达Foxq 1后CTNNB1、TCF 3及CYCLIND 1基因的mRNA表达量显著升高(P<0.05),免疫荧光进一步证明过表达Foxq 1后CTNNB1、TCF3及CYCLIND1蛋白水平的表达量显著升高。本研究发现,Foxq 1能够激活Wnt/β-catenin信号通路从而促进HFSCs的增殖,揭示了Foxq 1通过WNT/β-catenin信号通路影响绒山羊毛囊干细胞增殖的分子机理。

CDK5RAP1通过Wnt/β-Catenin信号通路调控结直肠癌发生和进展的研究

目的探讨周期素依赖性激酶5激活结合蛋白1(CDK5RAP1)通过Wnt/β-连环蛋白(β-Catenin)信号通路对结直肠癌(CRC)发生和进展的影响。方法选取2020年6月至2022年9月在贵阳市第一人民医院被首诊为CRC的72例患者的CRC组织和癌旁组织,检测组织中CDK5RAP1的表达水平。选取人CRC细胞系HCT-116、SW480、HT29、SW620、Caco-2及人正常结直肠上皮细胞系NCM460,检测各细胞中CDK5RAP1的表达水平。分别将si-NC和si-CDK5RAP1转染至HCT-116细胞中,分别将pc-NC和pc-CDK5RAP1转染至SW480细胞中,将SW480细胞分为SW480-CON组(正常培养细胞)、SW480-pc-NC组(阴性对照细胞)、SW480-pc-CDK5RAP1组(CDK5RAP1过表达细胞)和SW480-HLY78组(SW480-pc-CDK5RAP1+20μmol/L Wnt激活剂HLY78),将HCT-116细胞分为HCT-116-CON组(正常培养细胞)、HCT-116-si-NC组(阴性对照细胞)、HCT-116-si-CDK5RAP1组(CDK5RAP1低表达细胞)和HCT-116-HLY78组(HCT-116-si-CDK5RAP1+20μmol/L HLY78)。检测各组CRC细胞中CDK5RAP1的表达水平、CRC细胞存活率(增殖能力)、克隆、侵袭、迁移情况,以及CRC细胞成球率(细胞干性)。检测各组CRC细胞中β-Catenin、Axin1、c-Myc、CD133、CD44、SOX2蛋白的表达水平。选取18只BALB/C裸鼠随机分为CON组、si-NC组和si-CDK5RAP1组,每组6只,分别在各组裸鼠右前肢腋下注射对应的HCT-116细胞悬液,5周后处死裸鼠,剥离移植瘤并称重比较。结果CRC组织及细胞中CDK5RAP1的表达水平均显著高于癌旁组织和人正常结直肠上皮细胞(P均<0.05),且CDK5RAP1在HCT-116细胞中表达水平最高,在SW480细胞中表达水平最低,故分别使用HCT-116细胞和SW480细胞构建CDK5RAP1敲低和过表达的慢病毒载体转染细胞株。与SW480-CON组和SW480-pc-NC组比较,SW480-pc-CDK5RAP1组细胞的CDK5RAP1表达水平、细胞存活率、细胞克隆率、细胞划痕愈合率、细胞侵袭数量、细胞成球率及β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2蛋白表达水平均显著升高,Axin1蛋白表达水平显著降低(P均<0.05)。与HCT-116-CON组和HCT-116-si-NC组比较,HCT-116-si-CDK5RAP1组细胞的CDK5RAP1表达水平、细胞存活率、细胞克隆率、细胞划痕愈合率、细胞侵袭数量、细胞成球率及β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2蛋白表达水平均显著降低,Axin1蛋白表达水平显著升高(P均<0.05)。HLY78可促进过表达CDK5RAP1的SW80细胞的增殖、迁移、侵袭及干性,也可逆转CDK5RAP1低表达对HCT-116细胞增殖、迁移、侵袭和干性的抑制。si-CDK5RAP1组裸鼠移植瘤的质量较CON组和si-NC组均显著降低(P均<0.05),体积也显著缩小。结论CDK5RAP1靶向Wnt/β-catenin信号通路参与CRC的发生和进展。敲低CDK5RAP1表达可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制CRC细胞的增殖、迁移、侵袭和干性。

青娥丸调控Wnt1/β-catenin信号通路治疗糖尿病性骨质疏松症

目的探究青娥丸对糖尿病性骨质疏松症(diabetic osteoporosis,DOP)小鼠模型Wnt/β-catenin通路的影响。方法采用高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲菌素建立DOP小鼠模型,对小鼠进行药物干预,分为空白组、模型组、青娥丸低、中、高剂量组及阿仑膦酸钠组,进行一般状态观察,股骨组织进行HE染色,验证造模成功情况。生化检测各组小鼠碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、天冬氨酸转氨酶(AST)的水平,免疫组化检测股骨Wnt/β-catenin信号传导通路中相关蛋白Wnt1、β-catenin、Runx2表达水平,HE染色观察各组股骨组织细胞形态,qPCR检测股骨组织中GSK-3β、低密度脂蛋白受体相关基因5(LRP5)、COL1A1 mRNA水平。结果与对照组相比,模型组小鼠骨小梁间隔增大,骨小梁之间连接减少,小鼠多饮多尿少动,尾静脉血糖值增加(P<0.01),血清中ALP、BUN、AST含量和GSK-3βmRNA水平均增加(P<0.01),体重和LRP5、COL1A1 mRNA水平下调(P<0.01),Wnt1、β-catenin、Runx2蛋白呈少量阳性表达(P<0.01)。与模型组相比,青娥丸组和阿仑膦酸钠组骨小梁间隔变小,骨小梁间的连接增多,尾静脉血糖值下降(P<0.01),血清中ALP、BUN、AST含量和GSK-3βmRNA水平均减少(P<0.01),体重和LRP5、COL1A1 mRNA水平上调(P<0.01),Wnt1、β-catenin、Runx2蛋白阳性表达增多(P<0.01)。结论青娥丸可增强DOP小鼠骨组织的修复作用,其机制可能与Wnt1/β-catenin信号通路的激活有关。

紫花牡荆素通过miR-148a-3p/Wnt1信号通路抑制肝癌MHCC97H细胞的迁移和侵袭

目的用紫花牡荆素(casticin,CAS)处理MHCC97H细胞,观察其迁移和侵袭能力的变化,并初步探讨CAS的分子作用机制。方法CCK-8试剂盒检测不同浓度CAS对MHCC97H细胞活力的影响;分组开展细胞迁移和侵袭实验,评估MHCC97H细胞的迁移和侵袭能力;逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)检测CAS处理后,MHCC97H细胞的miR-148a-3p和Wnt1 mRNA表达变化;迁移侵袭相关蛋白(MMP2、MMP9)和Wnt1蛋白表达量采用Western blot检测;Dual-Luciferase报告基因检测miR-148a-3p与Wnt13′-UTR的结合情况。结果CAS明显抑制MHCC97H细胞的生存活力,其对这种细胞的IC_(50)约为10.0μmol·L^(-1),亚细胞毒浓度的CAS(3.0μmol·L^(-1))可减弱这种细胞的迁移和侵袭能力;miR-148a-3p mimic或CAS均能抑制MHCC97H细胞迁移和侵袭能力,且两者联合处理后的抑制作用强于单独使用;过表达Wnt1能有效减弱CAS的抑制作用;CAS能明显上调MHCC97H细胞miR-148a-3p表达,同时Wnt1、MMP2和MMP9的表达呈现下降;Dual-Luciferase报告基因发现,miR-148a-3p可以直接靶向Wnt13′-UTR。结论CAS可通过miR-148a-3p/Wnt1信号通路减弱肝癌细胞的迁移和侵袭。

大黄素调节Wnt1/β-catenin信号通路对垂体腺瘤HP75细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨大黄素调节Wnt1/β-catenin信号通路对垂体腺瘤HP75细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法以CCK-8法测定0、10、20、40、80、120μmol/L浓度大黄素处理24 h后的人垂体腺瘤细胞HP75的存活率,筛选出最佳药物作用浓度。体外培养HP75细胞并随机分为对照组、大黄素组、大黄素+氯化锂(Wnt1/β-catenin信号激活剂)组,以80μmol/L的大黄素和20 mmol/L的氯化锂分组处理后以免疫印记法检测各组细胞Wnt1/β-catenin通路相关蛋白表达;以Edu和TUNEL染色法分别检测各组细胞增殖、凋亡;以细胞划痕实验和Transwell实验分别检测各组细胞迁移、侵袭;以免疫印记法检测各组HP75细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)和上皮细胞-间充质转化(EMT)相关蛋白(E-cadherin、MMP-9、Vimentin)表达。构建垂体腺瘤裸鼠移植瘤模型并随机分为对照组、大黄素组、大黄素+氯化锂组,以10 mg/kg的大黄素和1 mg/kg的氯化锂分组处理后检测各组肿瘤体积。结果与对照组比较,大黄素组细胞凋亡率、Bax与E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05),增殖率、迁移率、侵袭数、Bcl-2与MMP-9、Vimentin、Wnt1、β-catenin蛋白表达、裸鼠肿瘤体积降低(P<0.05);与大黄素组比较,大黄素+氯化锂组细胞凋亡率、Bax与E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05),增殖率、迁移率、侵袭数、Bcl-2与MMP-9、Vimentin、Wnt1、β-catenin蛋白表达、裸鼠肿瘤体积升高(P<0.05)。结论大黄素可抑制垂体腺瘤细胞增殖、迁移、侵袭和体内肿瘤生长,并促进其凋亡,其作用机制可能与抑制Wnt1/β-catenin信号通路有关。

基于Wnt/β-catenin信号通路探索芪蛭通络方对糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化的作用机制

目的:基于Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路探讨芪蛭通络方对糖尿病肾病(DKD)大鼠肾间质纤维化的作用机制。方法:SD大鼠予高糖高脂饲料及腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制作DKD模型,取50只造模成功的大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组(每日14 mg/kg)和芪蛭通络方低、中、高剂量组(每日1.215 g/kg、2.430 g/kg、4.860 g/kg),每组10只。同时取10只SD大鼠予普通饲料和腹腔注射柠檬酸缓冲液,作为正常组。造模成功后,各给药组每日予相应药物灌胃,正常组和模型组每日灌胃等体积蒸馏水,各组均连续灌胃8周。收集处死前1 d各组大鼠24 h尿液,检测24 h尿蛋白定量(24 h-UTP);处死前尾静脉取血,测血糖(GLU);末次给药后5 h,各组大鼠予异氟烷吸入麻醉,腹主动脉取血,分离血清测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN);取双肾,采用苏木素-伊红(HE)染色法、马松(Masson)染色法观察各组大鼠肾脏组织病理变化;分别采用免疫组化(IHC)法、蛋白免疫印迹(Westernblot)法检测各组大鼠肾组织Wnt1、β-catenin、糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达。结果:模型组大鼠GLU、Scr、BUN、24 h-UTP水平均明显高于正常组(P<0.01),各给药组大鼠上述指标均明显低于模型组(P<0.01),芪蛭通络方高剂量组上述指标均明显低于厄贝沙坦组(P<0.01),芪蛭通络方对上述指标的改善作用表现出一定的剂量依赖性。病理图片显示,模型组大鼠肾小球结构遭到破坏,炎性改变明显,肾小管扩张,肾间质纤维化明显,肾组织蓝色胶原分泌增多且伴病理损伤;各给药组大鼠肾组织病理改变均有不同程度的改善,以芪蛭通络方高剂量组改善最为显著。免疫组化法及蛋白免疫印迹法结果显示,模型组大鼠Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表达均明显高于正常组(P<0.01);各给药组大鼠上述蛋白表达均明显低于模型组(P<0.05,P<0.01)。免疫组化法结果显示,芪蛭通络方高剂量组上述蛋白表达均明显低于厄贝沙坦组(P<0.05,P<0.01);蛋白免疫印迹法结果显示,芪蛭通络方高剂量组Wnt1、GSK-3β蛋白表达明显低于厄贝沙坦组(P<0.05,P<0.01),β-catenin、CTGF蛋白表达与厄贝沙坦组比较差异无统计学意义(P>0.05)。芪蛭通络方对上述蛋白的表达表现出一定的剂量依赖性。结论:芪蛭通络方可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路激活,在一定程度上延缓肾间质纤维化,从而起到保护肾功能的作用。