pcDNA3.1-Annexin A1真核表达载体对结直肠癌细胞迁移、侵袭的影响

目的探讨Annexin A1对结直肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响。方法构建重组质粒pcDNA3.1-AnnexinA1,转染至结直肠癌细胞株SW480中,G418筛选稳定表达株,实时荧光定量PCR、蛋白质印迹检测转染前后Annexin A1mR-NA及蛋白表达;以空载体转染组及未转染SW480细胞作为对照,通过划痕修复实验和Transwell细胞侵袭实验对转染前后细胞的迁移和侵袭能力进行比较观察和分析。结果成功构建重组质粒pcDNA3.1-Annexin A1载体;实时荧光定量PCR和蛋白质印迹检测结果均显示,重组体pcDNA3.1-Annexin A1稳定转染细胞株中Annexin A1mRNA及蛋白表达均明显高于空载体转染及未转染组细胞(P<0.01),而后两者间比较差异无统计学意义(P>0.05);重组体pcDNA3.1-Annexin A1转染组SW480细胞的迁移率(0.415±0.002)明显高于空载体转染组(0.267±0.003)及未转染组细胞(0.271±0.002),差异具有统计学意义(P<0.05),而后两者间差异无统计学意义(P>0.05);与空载体转染组(162.80±12.07)及未转染组(164.25±9.50)相比,重组体pcDNA3.1-Annexin A1转染组穿膜细胞数(221.75±12.07)增多,差异具有统计学意义(P<0.05).结论人Annexin A1基因表达上调能提高结直肠癌细胞迁移和侵袭能力。

小鼠睾丸膜联蛋白A1的克隆、表达及定位

目的:克隆、表达小鼠睾丸膜联蛋白A1,并研究其在睾丸中的定位。方法:利用RT-PCR技术从小鼠睾丸组织中扩增膜联蛋白A1的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T。以亲和层析法纯化蛋白免疫家兔制备多抗,并做睾丸切片免疫组织化学检测。结果:重组质粒测序结果表明,插入片段与小鼠膜联蛋白A1的序列完全一致。K802重组菌高效表达出相对分子质量为63 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%。多抗效价达1∶102 400,可特异识别重组蛋白。免疫组织化学显示膜联蛋白A1主要分布于精原细胞核、精子细胞顶体帽及精子胞质残余体内。结论:成功克隆、表达了小鼠膜联蛋白A1基因;膜联蛋白A1在睾丸生精细胞中的不同分布预示其可能与生精过程有关。

膜联蛋白A1在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

目的:检测膜联蛋白A1(annexin A1,ANXA1)在人非小细胞肺癌组织中的表达情况,并探讨其临床意义。方法:通过实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组织化学技术检测非小细胞肺癌患者肺癌组织和癌旁组织(距肿瘤边缘>5 cm)中膜联蛋白A1的表达水平,并分析其与临床病理参数之间的关系。结果:实时荧光定量PCR显示,膜联蛋白A1 mRNA在肺癌组织中的表达水平(0.574±1.403)高于癌旁组织(0.240±0.893),差异具有统计学意义(t=2.060,P=0.045)。肺癌组织中膜联蛋白A1的表达与其分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关(P<0.05);与性别、年龄、吸烟史、肿瘤直径、组织学类型无关(P>0.05)。蛋白免疫印迹和免疫组织化学结果均显示,膜联蛋白A1蛋白在肺癌组织中的表达高于癌旁组织。结论:ANXA1在非小细胞肺癌患者肺癌组织中呈高表达,可能与其发生发展和侵袭转移有一定关系。

膜联蛋白A1基因合成及其真核表达载体的构建

目的探讨人膜联蛋白A1(ANXA1)基因的合成并构建其克隆载体。方法根据ANXA1基因序列设计一对寡聚核苷酸引物,通过PCR反应合成一段长度为870bp的ANXA1基因。真核表达载体pEGFP-N3经KpnⅠ&BamHⅠ限制性内切酶双酶切处理后与合成的ANXA1基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞进行扩增,并提取质粒进行鉴定。结果 PCR扩增获得ANXA1基因,对PCR产物及重组质粒酶切后的凝胶电泳鉴定证实为与理论设计目的片段大小(870bp)相符的DNA基因片段,并成功地转入克隆载体pEGFP-N3中。测序分析显示合成的目的基因与GenBank中ANXA1基因序列同源性为99%,整个表达载体阅读框正确无误。结论成功构建了ANXA1基因pEGFP-N3表达载体,为下一步高效表达ANXA1蛋白和进一步研究其作用机理及应用价值打下基础。

狍茸顶端组织Anxa-1基因cDNA克隆及序列分析

为了初步探讨狍膜联蛋白A1(Anxa-1)基因的结构与功能,试验采用RT-PCR方法克隆得到包含全部编码区的东北狍Anxa-1基因cDNA序列,并利用生物学信息方法进行序列分析。结果表明:该基因编码346个氨基酸,相对分子质量为38 898.6,理论等电点为7.02,Anxa-1蛋白氨基酸序列与山羊、牛、猪、人、小鼠的氨基酸序列同源性分别为98%、98%、96%、94%、91%。系统进化树分析表明,在该基因座上狍与山羊、绵羊、水牛、牛等在进化上关系较近,与非洲爪蟾和非洲蟾蜍等关系较远。

过表达膜联蛋白A1的人脂肪间充质干细胞治疗急性呼吸窘迫综合征小鼠的效果及其机制

目的探索过表达膜联蛋白A1(ANXA1)的人脂肪间充质干细胞(AMSC)治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)小鼠的效果及其机制。方法采用实验研究方法。采用流式细胞术鉴定成人AMSC后,取第3代细胞进行后续实验。采用随机数字表法(分组方法下同),将细胞分为转染含ANXA1基因RNA序列的质粒的过表达ANXA1组、转染对应空载质粒的空载对照组,另取细胞分为转染含ANXA1基因小干扰RNA序列的质粒的敲减ANXA1组、转染对应空载质粒的空载对照组,转染后72 h,于荧光显微镜成像系统下观察荧光表达情况,分别采用蛋白质印迹法和实时荧光定量反转录PCR法检测ANXA1的蛋白和mRNA表达(样本数均为3)。取50只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠,分为假伤组、单纯ARDS组、正常细胞组、过表达ANXA1组、敲减ANXA1组,每组10只。将后4组小鼠均用内毒素/脂多糖制成ARDS肺损伤模型,假伤组小鼠模拟致假伤。伤后即刻,假伤组、单纯ARDS组小鼠均经尾静脉注射生理盐水,正常细胞组、过表达ANXA1组、敲减ANXA1组小鼠对应注射正常AMSC、过表达ANXA1的AMSC、敲减ANXA1的AMSC。注射后24 h,取每组5只小鼠,行伊文思蓝染色观察右肺组织大体染色情况,采用酶标仪检测左肺支气管肺泡灌洗液(BALF)上清液的吸光度值,了解肺血管通透性。注射后3 d,取各组剩余5只小鼠,取右肺组织,行苏木精-伊红染色观察病理学变化,行免疫组织化学染色观察CD11b和F4/80阳性巨噬细胞情况;采用酶联免疫吸附测定法检测左肺BALF上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和IL-1β水平。对数据行配对样本t检验、单因素方差分析与LSD检验。结果转染后72 h,过表达ANXA1组与敲减ANXA1组AMSC均分别较对应空载对照组AMSC表达更高强度的荧光。转染后72 h,与对应空载对照组比较,过表达ANXA1组AMSC中ANXA1蛋白与mRNA表达均明显增多(t值分别为249.80、6.56,P<0.05),敲减ANXA1组AMSC中ANXA1蛋白与mRNA表达均明显减少(t值分别为176.50、18.18,P<0.05)。注射后24 h,与假伤组(BALF上清液的吸光度值为0.041±0.009)比较,单纯ARDS组小鼠肺组织明显蓝染且BALF上清液的吸光度值(0.126±0.022)明显升高(P<0.05);与单纯ARDS组比较,正常细胞组、过表达ANXA1组小鼠肺组织蓝染程度明显减轻且BALF上清液的吸光度值(0.095±0.020、0.069±0.015)明显降低(P<0.05),敲减ANXA1组小鼠肺组织蓝染程度与BALF上清液的吸光度值(0.109±0.016,P>0.05)无明显变化;与正常细胞组比较,过表达ANXA1组小鼠BALF上清液的吸光度值明显降低(P<0.05)。注射后3 d,单纯ARDS组小鼠肺组织结构较假伤组明显损伤;与单纯ARDS组比较,正常细胞组和过表达ANXA1组小鼠肺组织出血、炎症细胞浸润、肺泡萎陷及间质增宽程度等改变均明显减轻,敲减ANXA1组小鼠前述肺组织表现未明显改善。注射后3 d,单纯ARDS组小鼠肺组织中CD11b和F4/80阳性巨噬细胞数量均较假伤组明显增多;与单纯ARDS组比较,正常细胞组、过表达ANXA1组、敲减ANXA1组小鼠肺组织中CD11b和F4/80阳性巨噬细胞数量均减少,以过表达ANXA1组减少最明显。注射后3 d,与假伤组比较,单纯ARDS组小鼠BALF上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著升高(P<0.05);与单纯ARDS组比较,正常细胞组、过表达ANXA1组小鼠BALF上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平以及敲减ANXA1组小鼠BALF上清液中IL-1β水平均明显降低(P<0.05);与正常细胞组比较,过表达ANXA1组小鼠BALF上清液中TNF-α水平明显降低(P<0.05),敲减ANXA1组小鼠BALF上清液中TNF-α水平明显升高(P<0.05)。结论过表达ANXA1可以优化AMSC在ARDS治疗中的效果,增强该类细胞抑制炎症反应和改善肺血管通透性的作用,进而缓解ARDS小鼠的肺损伤。

中国人膜联蛋白A1基因单核苷酸多态性及其与2型糖尿病的相关性

目的 筛查上海地区汉族人群中膜联蛋白 A1(annexin A1,ANXA1)基因的单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms,SNPs) ,并通过关联分析研究其与 2型糖尿病的相关性。方法 选取2 4例 2型糖尿病患者的 DNA样本 ,采用直接测序法对 ANXA1基因的启动子区、全部外显子及其临近内含子区作 SNPs筛查 ,并在其余的 171例 2型糖尿病和 189名正常对照间作进一步的基因分型。结果ANXA1基因测序长度 6 798bp,共检出 7个 SNPs,其中启动子区 2个 (- 7974 C>T,- 70 4 0 G>T) ,内含子区 3个 (+90 5 9A>G,+92 0 4 C>T,+10 4 86 A>G) ,5′-非翻译区 1个 (- 6 6 14 A>G) ,编码区 1个(+1784 A>G)。进一步的基因分型后显示这些 SNPs的等位基因频率在 2型糖尿病和正常对照组之间差异无显著性 (P>0 .0 5 )。结论 ANXA1基因多态性与上海地区汉族人群中 2型糖尿病无显著相关性。