盐酸沙丙蝶呤及关键原料生物蝶呤的合成进展

苯丙酮尿症是一种罕见的苯丙氨酸代谢障碍引起的常染色体隐性疾病。苯丙酮尿症是由苯丙氨酸羟化酶基因突变导致体内苯丙氨酸羟化酶缺乏引起的。盐酸沙丙蝶呤于2007年12月被美国FDA批准上市,是唯一用于治疗四氢生物蝶呤反应性苯丙酮尿症的药物,由于其结构复杂及手性难控制等特点导致合成困难。在此,我们对盐酸沙丙蝶呤及其关键原料生物蝶呤的合成进行了综述。

小儿尿液中的新蝶呤及生物蝶呤检测方法优化

目的基于高效液相色谱法(HPLC)同时检测小儿尿液中新蝶呤(N,CAS No:2009-64-5)和生物蝶呤(B,CAS:22150-76-1)的含量并探究KI-I氧化的条件。方法采用KI-I2法氧化原型新蝶呤及生物蝶呤,在激发波长为350 nm,发射波长460 nm下使用HPLC进行检测,其中色谱柱选用Kromasil EternityXT C18(4.6*250mm,5μm),流动相为甲醇:水(10:90)。结果新蝶呤及生物蝶呤的线性均在0.9999以上,检测范围为新蝶呤:0.00625mg/mL~1.0mg/mL,生物蝶呤:0.00675 mg/mL~1.08 mg/mL,加标回收率在92.18%~98.24%。氧化过程中,普通实验室的光照对实验无明显的影响,氧化前不酸化尿液会造成测量的N、B值减小。结论使用优化方法检测小儿尿液中的新蝶呤、生物蝶呤与尿肌酐的含量比值,并通过计算B%(百分比),有助于高苯丙氨酸的鉴别分型,对患儿的治疗及预防发病具有重要意义。

SHR高血压进程中肾脏蛋白表达谱的变化

目的探讨SHR大鼠在高血压发展进程中,肾脏蛋白表达谱的变化。方法将SHR随机分为3组:18、24和32周龄,每组各6只,相同周龄的WKY作为对照,两周尾动脉测一次血压,肾脏组织蛋白提取、纯化后做双向电泳分析,图谱经PDQuest软件分析后得到的差异蛋白点用串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF MS)分析鉴定。Western blot测定肾脏铜锌超氧化物歧化酶、过氧化物酶2蛋白的表达。结果 SHR从6周开始血压持续上升,20周后血压值稳定。双向电泳显示,存在11个差异确定蛋白,其中5个变化蛋白涉及氧化应激方面,分别是NADH脱氢酶[辅酶]黄素蛋白2、过氧化物酶2、铜锌超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫转移酶ω-1、肝再生相关蛋白LRRG07。SHR随着周龄的增加,铜锌超氧化物歧化酶和肝再生相关蛋白LRRG07降低,谷胱甘肽硫转移酶ω-1在18周时就基本消失,而过氧化物酶2及NADH脱氢酶[辅酶]黄素蛋白先下降后上升。存在两个变化蛋白涉及细胞凋亡方面,分别是谷胱甘肽硫转移酶ω-1和α-B晶状体。SHR中α-B晶状体随着周龄的增加,先增加后保持一致。存在3个变化蛋白涉及能量代谢方面,分别是H+ATP运输合酶、V型质子ATP酶亚基E1和ATP合酶(α亚基)。SHR在3个不同周龄都是先升高后下降。二氢喋啶还原酶涉及生物蝶呤代谢,而3-羟基蒽醌3,4-双加氧酶参与喹啉酸自环化,随着周龄的增加,SHR中二氢喋啶还原酶下降。Western blot显示SHR肾脏中铜锌超氧化物歧化酶的含量均呈不断下降状态,而过氧化物酶2是先下降后上升。结论在高血压的进程,我们推测所引起的肾脏损伤与氧化应激、细胞凋亡、生物蝶呤代谢和能量代谢有关。体内调节其相关物质可使高血压恢复到一个动态平衡之中,为不同时期治疗高血压肾损伤提供了一个新的思路。

高效液相色谱法同时测定尿中新喋呤和生物喋呤

建立了同时分离检测尿中新喋呤 (neopterin ,NP)和生物喋呤 (biopterin ,BP)的高效液相色谱 (HPLC) 荧光检测方法。采用HypersilBDSC18柱、甲醇 水 (体积比为 10∶90 )流动相 (流速 0 5mL/min)、激发波长 36 0nm、发射波长 4 4 0nm、柱温 2 0℃的色谱条件 ,同时分离测定了尿中的NP和BP。尿标本经三氯乙酸处理 ,在 4℃下 ,以 12 0 0 0r/min的速率离心 15min ,上清液用碱中和后 ,取 30 μL直接进样。研究结果表明 ,NP的线性范围为 0 12～ 10 0 0μg/L ,BP的线性范围为 0 4 8～10 0 0 μg/L ;NP和BP的检测限分别为 0 .0 1和 0 .1μg/L ,日内精密度 (以相对标准偏差 (RSD)表示 )分别为 1.0 9%和 3.39% ,平均回收率分别为 10 0 .7%和 10 0 .3%。用该法测定了正常人和尿毒症病人尿中的NP和BP ,同时用苦味酸法测定了尿肌酐 (Cr) ,发现尿毒症病人尿中的NP与Cr和NP与BP的浓度比值较正常组有显著性升高 (P <0 .0 5 ) ,而BP与Cr的浓度比值无显著性变化。该方法简便、稳定、可行 ,可同时检测尿中NP和BP ,适用于临床尿标本的检测。

蝶呤类化合物的荧光性能研究

研究了蝶呤类化合物的天然荧光特性。着重考察了新蝶呤、生物蝶呤、黄蝶呤和蝶呤在 p H7.7磷酸盐缓冲溶液条件下的荧光光谱及各种因素对其荧光强度的影响。在最佳实验条件下 ,四种蝶呤类化合物的线性范围为 :蝶呤 0 .6～ 2 .8μg/m L,新蝶呤 0～ 2 .6μg/m L,生物蝶呤 0～ 2 .4μg/m L,黄蝶呤 0～ 6.0 μg/m L,检出限依次为 :4.2 9× 1 0 - 7g/m L,6.71× 1 0 - 8g/m L,5.79× 1 0 - 9g/m L和 1 .75× 1 0 - 8g/m

抑制生物蝶呤合成对大鼠烫伤后金葡菌感染所致肺损伤的影响

为探讨生物蝶呤 (BH4 )在金黄色葡萄球菌 (简称金葡菌 )脓毒症所致急性肺损伤中的作用及BH4 合成抑制剂的防护效应 ,将 5 6只动物随机分为正常对照组、烫伤对照组、烫伤后金葡菌感染组和 2 ,4 二胺 6 羟基嘧啶 (DAHP)拮抗组。分别检测肺组织三磷酸鸟苷环水解酶I(GTP CHI)、诱生型一氧化氮合酶 (iNOS)基因表达 ,以及BH4 和一氧化氮 (NO)等介质的含量。结果显示 ,早期给予生物蝶呤合成限速酶抑制剂 (DAHP不仅可显著抑制组织GTP CHI基因表达和BH4 的产生 ,iNOS基因表达和NO生成亦明显受抑 (P <0 .0 5 )。同时 ,注射DAHP可在一定程度上减少肺组织肿瘤坏死因子 α的产生 (P <0 .0 5 ) ,肺组织髓过氧化物酶活性也有所下降。本结果表明 ,严重烫伤后金葡菌感染所致BH4 大量产生可能是介导急性肺损伤的重要原因之一 ,感染早期及时抑制BH4

GCH1基因、BH4对疼痛的作用机制研究进展

疼痛是人类日常生活中常见的一种机体反应。按疼痛持续时间可分为急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛常为某些急性损伤的防御反应;而慢性疼痛的发生为多因素作用,其具体机制尚不明确。生物遗传机制可能是导致慢性疼痛的关键因素。GTP环氢化酶1基因和四氢生物蝶呤在疼痛发病机制中发挥重要作用,对阐明疼痛遗传机制和潜在治疗策略有重要的意义。

窒息新生儿脐血中一氧化氮合酶、生物喋呤、新喋呤变化的临床意义

目的通过观察窒息新生儿血浆一氧化氮合酶（NOS）、生物喋呤（BP）、新喋呤（NP）的变化来了解新生儿窒息及其程度的轻重与这三项指标的相关性，以探讨NOS、BP、NP是否参与窒息的病理生理过程。方法轻度窒息15例，重度窒息15例为病例组，30例同期正常新生儿作为对照组，用固相夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）方法测定血浆中的NOS，高压液相色谱法（HPLC）测定血浆中的BP、NP，同时观察各临床指标的变化。结果重度窒息组血浆NOS、BP、NP均高于轻度窒息组和对照组，差异有高度显著性意义；轻度窒息组血浆NOS、BP、NP均与对照组差异无显著性意义。结论NOS、BP、NP参与了窒息的病理生理过程，可作为新生儿窒息后脑损伤判断的有效指标。

4-氨基-L-赤-生物蝶呤的全合成研究

报道了两种合成 4 氨基 L 赤 生物蝶呤 (2 )的方法 :(1)以 2 N 1′ ,2′ O 三乙酰基 L 赤 生物蝶呤 (3)为原料 ,经 4 O 甲基化、氨解而得 2 ;(2 )为 4 氨基 L 赤 生物蝶呤 (2 )的“一锅法”全合成 ,即通过保护了的 5 脱氧 L 阿拉伯糖 (9)和 2 ,4,5 ,6 , 四氨基嘧啶缩合 ,经碘氧化得到二乙酰氨基生物蝶呤 (11) ,11的进一步乙酰化后即可经硅胶柱层析纯化 ,获得四乙酰基氨基生物蝶呤 (12 ) ,用NH3 H2 O/MeOH皂化 12即得 2 .5 脱氧 L 阿拉伯糖 (7)由L 鼠李糖二乙基缩硫醛衍生物 (5 )制得 ,这样由 5制备 2的总收率为 17%.

The effect of 2,4-diamino-6-hydroxy-pyrimidine on PoStburn Staphylococcus aureus sepsis in rats

Objective;GTP-cyclohydrolase I (GTP-CHI) is the first and rate-limiting enzyme for the de novo bio-synthesis of biopterin.The present study was to observe the effect of 2,4-diamino-6-hydroxy-pyrimidine (DAHP),an inbibtor of GTP-CHI,on the development of postburn Staphylococcus aureus sepsis.Methods;56 male Wistarrats were randomly divided into four groups as follows;normal control group (n=10),scald control group(n=10),postburn sepsis group (n=20) and DAHP treatment group (n=16).In the scald control gro...

血清新喋呤、生物喋呤检测及其在尿毒症患者中的应用

目的探讨尿毒症患者血清中新喋呤(NP)和生物喋呤(BP)的浓度变化及其临床意义。方法采用反相高效液相色谱-荧光检测(RP-HPLC-FD)的方法,分别测定正常对照组、尿毒症组透析前后血清中的NP、BP浓度,并进行比较。结果尿毒症组血清中的NP、BP浓度和NP/BP比值均显著高于正常组(P<0.01),透析后血清中的NP、BP浓度显著低于透析前血清中NP、BP浓度(P<0.01,P<0.05),而NP/BP比值差异无显著性(P>0.05)。结论在尿毒症患者中,血清中的NP、BP浓度可作为炎性介质激活的灵敏指标,同时可作为判断肾功能好坏的标志物。

尿蝶呤检测在高苯丙氨酸血症鉴别诊断中的应用

目的利用高效液相色谱技术(HPLC)建立尿蝶呤谱的检测方法,检测小儿尿液中新蝶呤(neopterin, N)和生物蝶呤(biopterin, B)的水平,分析方法的检测性能,评估该方法用于新生儿高苯丙氨酸血症(HPA)鉴别诊断的可行性。方法(1)检测新蝶呤和生物蝶呤标准品,评估HPLC检测尿蝶呤的性能;(2)检测16例确诊的HPA样本,评估该方法用于新生儿HPA鉴别诊断的可行性。结果 (1)HPLC检测N和B的批内和批间精密度分别为:N(3.91%~8.20%,3.70%~5.77%)和B(4.06%~8.19%,3.55%~5.67%),符合精密度要求;(2)处理好的尿液样本在-20℃储存,稳定性较好;(3)16例HPA患儿的N和B检测结果与临床诊断一致。结论 HPLC检测N和B水平的性能参数符合实验要求,可用于HPA患儿的鉴别诊断。

重组杀菌/通透性增加蛋白对内毒素休克中肝脏一氧化氮合酶的影响

目的：探讨重组杀菌／通透性增加蛋白（ｒＢＰＩ_(２１)）对内毒素休克中肝组织一氧化氮合酶（ＮＯＳ）的影响及其意义。方 法：大鼠腹腔注射大肠杆菌内毒素（１５．０ｍｇ／ｋｇ）复制内毒素休克模型，动物随机分成正常对照组、内毒素休克组和 ｒＢＰＩ_(２１)治疗组。检测肝组织ＮＯＳ活性、三磷酸鸟苷环水解酶１（ＧＴＰ－ＣＨＩ）活性及生物喋呤含量，同时还观察肝脏微循环 血流灌注量的改变。结果：内毒素攻击后肝组织诱生型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）活性急剧升高（Ｐ＜０．０１），但原生型ＮＯＳ（ｃＮＯＳ）活 性变化不明显（Ｐ＞０．０５）。 ｒＢＰＩ_(２１)治疗可显著抑制ｉＮＯＳ活性，明显提高肝脏微循环灌注量（Ｐ＜０.０１）；同时局部组织的 ＧＴＰ－ＣＨＩ活性降低（Ｐ＜０．０１），生物喋呤含量也显著Ｆ降（Ｐ＜０.０５）。结论：内毒素休克早期给予ｒＢＰＩ_(２１)能选择性抑制肝 组织ｉＮＯＳ活性并改善局部微循环，其作用机理可能与降低组织ＧＴＰ－ＣＨＩ活性及其介导生物喋呤诱生有关。

生物喋呤合成酶抑制剂在大鼠烫伤后金葡菌脓毒症防治中的意义

目的:采用大鼠20%体表面积Ⅲ°烫伤后金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)攻击所致脓毒症模型,探讨生物喋呤合成限速酶抑制剂-2,4-二胺-6-羟基嘧啶(DAHP)在金葡菌脓毒症防治中的意义。方法:56只动物随机分为正常对照组、烫伤对照组、烫伤后金葡菌感染组和DAHP拮抗组。无菌留取动物心、肝、肺、肾组织,采用RT-RCR方法检测三磷酸鸟苷环水解酶Ⅰ(GTP-CHI)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)及肿瘤坏死因子-β(TNF-α)基因表达,同时测定上述组织中四氢生物喋呤(BH_4)和一氧化氮(NO)的水平。结果:烫伤后金葡菌感染可导致组织GTP-CHI基因表达广泛上调、BH_4合成显著增加。与之相对应,组织iNOS基因表达和NO水平亦明显升高,其中肝、肺改变尤为显著。给予DAHP不仅可显著抑制各组织GTP-CHI基因表达和BH_4的产生,iNOS基因表达和NO的生成亦明显受抑,同时TNF-(基因表达也明显降低。此外,DAHP拮抗组动物6h死亡率明显降低(与未拮抗组相比,P=0.08,趋于统计学意义)。结论:早期应用DAHP进行干预可在一定程度上改善革兰阳性菌脓毒症动物的预后,其作用机理可能与DAHP抑制了体内BH_4和NO的产生有关。

大鼠微灌注脑复康对穿梭行为及脑代谢的影响

在40只大鼠中研究了不同剂量脑复康(20、200、300mg/g)对其穿梭行为及利用HPLC法研究了上述三种剂量对6个脑区还原型辅酶Ⅰ、黄素辅酶和生物蝶呤等物质含量的影响.结果表明:三种剂量脑复康与生理盐水组对比,穿梭行为指标在训练的后几天中其条件性躲避反应次数明显增多,NADH含量在各脑区无明显变化,20、200、300mg/g组在脑干的FAD含量显著降低.20mg/g组在尾核、小脑和脑干的生物蝶呤含量显著降低.

高苯丙氨酸血症表型与基因型研究进展

高苯丙氨酸血症(HPA)是最常见的先天性、常染色体隐性遗传的氨基酸代谢病,由苯丙氨酸羟化酶(PAH)或辅酶四氢生物蝶呤(BH4)缺乏所致,并受基因调控。HPA临床数据与基因信息是疾病诊断、治疗和预防的宝贵资源,信息的有效积累将推动HPA诊治更加及时和准确,为制订个性化的诊疗方案提供新手段。本文总结了HPA代谢途径与蛋白PAH和BH4的关联、HPA的致病基因及其分布、HPA的基因型与表型的关系,为HPA的个性化治疗提供参考。

山莨菪碱对脓毒症大鼠肺组织生物喋呤的影响

目的 :探讨山莨菪碱对脓毒症大鼠肺组织生物喋呤产生的影响及其意义。方法 :采用大鼠盲肠结扎穿孔 (CL P)致脓毒症模型 ,动物随机分为正常对照组、脓毒症组和山莨菪碱治疗组。分别于 CL P后 2、8、16小时处死动物 ,检测肺组织生物喋呤及其合成限速酶三磷酸鸟苷环水解酶 I(GTP CHI) m RNA表达和肿瘤坏死因子α(TNFα) m RNA表达的改变。结果 :脓毒症动物肺组织生物喋呤含量显著升高 ,GTP CHI基因表达水平也显著增强 ,而且其改变与局部 TNFα m RNA表达水平呈正相关。给予山莨菪碱治疗后 2小时 ,组织生物喋呤含量、GTP CHI m RNA表达及 TNFα m RNA表达水平均明显下降 (P<0 .0 5或 P<0 .0 1) ,且肺组织髓过氧化物酶活性也显著降低 (P<0 .0 5 )。结论 :脓毒症早期应用山莨菪碱能有效抑制肺组织生物喋呤及其合成限速酶基因表达 。

四氢生物蝶呤负荷试验诊断四氢生物蝶呤反应性苯丙氨酸羟化酶缺乏症的临床研究

目的探讨四氢生物蝶呤(BH4)反应性苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺乏症的临床诊断方法,进一步了解其临床特征,为该型患儿应用BH4药物治疗提供科学依据。方法73例高苯丙氨酸血症(HPA)患儿,男47例,女26例,平均年龄1.93个月。所有患儿都进行口服BH4负荷试验,同时进行尿蝶呤谱分析、红细胞二氢蝶啶还原酶测定。对其中血苯丙氨酸(Phe)浓度<600μmol/L者给予口服Phe BH4联合负荷试验,对部分BH4反应性PAH缺乏症患儿,在普食条件下给予BH4片剂(10～20mg/kg)替代治疗6～7天,观察其疗效。结果(1)在BH4负荷试验中,不同类型HPA患儿的血Phe浓度表现出特征性的曲线改变,22例诊断为经典型苯丙酮尿症(PKU),39例中度PKU,12例四氢生物蝶呤缺乏症;(2)在中度PKU患儿中发现22例(56.4%)对BH4有反应;(3)6例BH4反应性PAH缺乏症患儿以BH410mg/kg治疗6～7天,其中4例血Phe浓度能控制到正常或接近正常治疗水平,另2例BH4需增加到20mg/kg使Phe浓度显著下降。结论在BH4负荷试验中,部分因苯丙氨酸羟化酶缺乏引起的中轻度PKU患儿对BH4有反应性,给予这些患儿BH4治疗可部分或全部替代低苯丙氨酸饮食治疗,拓宽了PKU的治疗方法,有助于提高患儿的生活质量。

769例高苯丙氨酸血症诊治和基因研究

目的 对 76 9例高苯丙氨酸血症 (HPA)患者进行诊治随访和基因检测。方法 对 76 9例 (新生儿筛查获诊 95例 ,高危筛查获诊 5 0例 ,非筛查获诊 6 2 4例 )患者进行家族史调查 ;采用Guthrie细菌抑制法或定量荧光检测法进行血苯丙氨酸浓度测定 ;采用尿蝶呤分析进行四氢生物蝶呤缺乏症(BH4D)鉴别诊断 ;采用低或无苯丙氨酸奶粉对苯丙酮尿症 (PKU)患者进行治疗 ;评价各型HPA临床疗效 ;应用变性梯度凝胶电泳 (DGGE)及微卫星连锁分析等方法 ,对 10 0例经典型PKU患者进行PKU致病基因突变检测 ;对 2 3个PKU高危家庭进行产前诊断。结果 (1) 76 9例中 730例为经典型PKU ,2 7例轻型HPA ,12例BH4D。 (2 ) 338例接受了低 /无苯丙氨酸奶粉治疗 ,治疗期间血苯丙氨酸浓度控制达良好和一般的 ,95例新生儿筛查获诊者中占 71 6 % ,非筛查获诊的 2 4 3例中占 5 4 7%。 (3)对治疗者中 112例进行智能测定 ,5 5例经筛查获诊者的智商 (IQ)为 (78± 2 2 )分 ,5 7例非筛查获诊者的IQ为 (6 2± 18)分 ,两组IQ差异有显著意义 (P <0 0 0 1) ;5例接受治疗的BH4D者IQ 70～ 80分。 (4) 72例正常入学者 ,6 6 7%患者学习成绩达中等或以上。 (5 )在 10 0例经典型PKU中发现 5种基因突变(Arg111Ter、Arg2 4 1Cys、Arg2 4 3Glu。

四氢生物蝶呤缺乏症鉴别诊断的进展及发病率调查

目的了解我国各省（市）、自治区对高苯丙氨酸血症（hyperphenylalaninemia，HPA）患儿进行四氢生物蝶呤缺乏症（tetrahydrobiopterin deficiency，BH4D）鉴别诊断的普及情况及BH4D的发病率。方法选取1993--2007年接受BH4D鉴别诊断的1392例HPA患儿（门诊591例，递送标本801例）为研究对象。根据门诊及实验室资料统计BH4D鉴别诊断的病例数，探讨诊断标准，得出BH4D发病率及高发地区。结果（1）近3年尿蝶呤谱分析及红细胞二氢蝶啶还原酶（dihydropteridine reductase，DHPR）活性测定的病例数明显递增，2005年2项试验的病例数分别为217例和198例，至2007年病例数分别达到511例和458例，病例总数约为2005年的2．3倍，覆盖全国29个省（市）、自治区；（2）尿生物蝶呤及生物蝶呤百分比是诊断6－丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏症（6-pyruvoyl tetrahydropterinsynthase deficiency，PTPSD）的关键指标，96．83％（61／63）PTPSD患儿尿生物蝶呤百分比〈5％[（1．41±1．10）％]，生物蝶呤极低[（0．14±0．17）mmol／mol肌酐]；四氢生物蝶呤（BH4）负荷试验2～6h血苯丙氨酸浓度降至正常有助于诊断；DHPR活性降低是DHPR缺乏症的确诊方法；（3）1392例HPA患儿中PTPSD及DHPR缺乏症的发病率分别为8．41％（117／1392）和0．18％（2／1108）；80％（8／10）的高发省（市）、自治区位于我国的华东及南部；上海PTPSD在HPA患儿及新生儿群体中发病率分别为10．81％（8／74）和0．007‰（8／1121429）。结论近3年我国大部分省（市）、自治区临床医生开展BH4D鉴别诊断的意识明显提高；BH4D在HPA患儿中的发病率至少为8．55％（119／1392），PTPSD占98．32％（117／119）。