Establishment and characterization of murine bone marrow stromal macrophage line

The authors established a murine bone marrow stromal cell line QXMSC1 by discarding the suspensible hematopoietic cells and passaging the adherent stromal cells many times in long_term bone marrow culture. QXMSC1 cells have been passaged 65 times for 15 months and immortalized. The mean number of QXMSC1 chromosomes is 66±4. The appearance of the cells is elliptical. There are many pseudopods and mononuclei under the optical microscope. Many lisosomes and phagosomes in cytoplasm exist under the transmission electron microscope. There are no desmosome junction between the cells, no lipid drops, no intermediate filament. Vimentin is positive and keratin is negative by stain of immunocytochemistry. Nonspecific lipase staining is positive. These results indicate that QXMSC1 cells are murine bone marrow macrophages.

骨髓基质细胞系QXMSC_1体外促进造血及其作用机理的研究

本实验研究了骨髓基质细胞系QXMSC_1体外对CFU-F,CFU-GM,BFU-E及CFU-E集落形成的影响,并通过建立QXMSC_1基质细胞与骨髓造血细胞的长期共培养体系,研究了QXMSC-1在体外促进造血的机理。结果表明,QXMSC_1基质细胞条件培养上清液可促进小鼠CFU-F,CFU-GM,BFU-E及CFU-E集落的生长。在无GM-CSF和Epo存在的情况下,QXMSC_1细胞能维持CFU-GM,BFU-E和CFU-E集落生长。表明QXMSC_1细胞本身可分泌GM-CSF和Epo。QXMSC_1细胞与骨髓造血细胞共培养时,可明显提高CFU-GM集落数。共培养体系中,用微孔滤膜隔断QXMSC_1与造血细胞的直接接触,也能促进CFU-GM集落生成,但比混合培养时低,说明QXMSC_1通过直接接触和分泌细胞因子促进造血的过程。

促红细胞生成素促进骨髓基质细胞成骨分化的实验研究

目的:研究促红细胞生成素(EPO)通过ephrinB2/EphB4信号通路在细胞成骨分化中的作用。探讨EPO在骨稳态中的作用及其机制。方法:体外培养小鼠骨髓基质细胞系(ST2),加入EPO后,采用real-time PCR方法检测EphB4的表达以及成骨细胞相关基因的表达,采用ALP活性检测和茜素红染色观察EPO对成骨细胞功能的影响;在体外培养的ST2细胞中加入ephrinB2-Fc蛋白,模拟破骨细胞-成骨细胞共培养,使ephrinB-EphB4正向信号激活,采用上述方法检测其对成骨细胞的影响;进一步采用RNAi技术,使EphB4基因沉默,检测EPO对成骨细胞的影响。结果:EPO能增加ST2细胞RUNX2、ALP和Col1等成骨细胞相关基因的表达,同时伴随ST2细胞表面EphB4的表达升高,ALP活性和钙结节也增加;在模拟破骨细胞-成骨细胞共培养体系中,EPO也能促进ST2细胞的成骨向分化和功能;EphB4基因沉默后,EPO对ST2细胞的作用被减弱。结论:EPO能促进成骨细胞的分化和功能,该作用是通过ephrinB2/EphB4信号介导的。

表达人Jagged1基因的骨髓基质细胞系的建立及其在HL-60细胞分化过程中的作用

目的 :建立表达人Jagged1基因的骨髓基质细胞系 ,并研究Jagged1基因表达在HL 6 0细胞诱导分化过程中的作用。 方法 :构建含有人全长Jagged1基因的逆转录病毒载体MSCV Jagged1 /neoR ,将其导入包装细胞PT6 7并收获病毒上清 ,用病毒上清转染骨髓基质细胞系HFCL ,经G4 1 8筛选得HFCL pMSCV Jagged1细胞 ,用Western印迹方法检测Jagged1基因的表达 ;将HL 6 0细胞与HFCL pMSCV Jagged1细胞、HFCL细胞在含有全反式维甲酸 (ATRA )的培养液中共培养 ,流式细胞仪检测不同时间点HL 6 0细胞CD1 1b的阳性率。 结果 :Western印迹方法证明HFCL pMSCV Jagged1细胞Jagged1表达水平明显高于HFCL细胞 ;HL 6 0细胞与HFCL pMSCV Jagged1、HFCL共培养 4 8和 72h后 ,CD1 1b阳性率在Jagged1组明显低于HFCL组 (P <0 .0 5 )。 结论 :Jagged1基因表达可以较为显著地抑制ATRA诱导的HL 6

小鼠骨髓内皮细胞系的建立(英文)

对来源于正常小鼠的骨髓内皮细胞经连续传代培养18个月以上。这一培养是在加入经短期培养而获得的内皮细胞条件培养液及GM-CSF,在纤连蛋白覆盖的培养皿上种入低浓度的骨髓基质细胞完成的。在内皮细胞条件培养液和GM-CSF存在的条件下,细胞平均倍增时间为49小时。快速增殖时,细胞先为圆形,以后可变为立方形或梭形。所有培养的细胞与vWF,VCAM-1抗体染色阳性,UEA-1反应阳性,并产生细胞因子。这一骨髓内皮细胞系的建立可用于研究骨髓内皮细胞在造血过程中的作用。

FLT3配基在人骨髓基质细胞系中的基因转移与表达

目的 :研究逆转录病毒介导的FL在骨髓基质细胞系HFCL中的表达。方法 :采用脂质体法将重组质粒pLF SN/HFCL和空载体 pLXSN/HFCL转染包装细胞PA317,G418筛选抗性克隆 ,用抗性克隆上清液感染HFCL。RT PCR和基因组DNA PCR检测外源基因mRNA水平的表达及染色体的整合 ,小鼠CFU GM集落法检测FL生物学活性。结果 :在mRNA水平有FL的表达 ,染色体基因组中整合有标记neo基因和FL基因。活性测试结果显示转染的骨髓基质细胞分泌FL。结论

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞移植抑制大鼠脑出血后神经细胞的凋亡

目的探讨移植胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰的骨髓基质干细胞(BMSCs)对大鼠脑出血后神经细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响。方法通过脑立体定位仪向SD大鼠脑尾壳核注射胶原酶和肝素建立脑出血动物模型,将48只模型大鼠随机分为BMSCs组、GDNF/BMSCs组和生理盐水组,各组又根据细胞移植后再喂养时间的不同(1周、2周)分为2个亚组,每亚组8只大鼠。于建模后第3天在脑出血部位分别移植BMSCs、GDNF/BMSCs或注射生理盐水,采用神经功能缺失评分和HE染色评估大鼠神经功能缺失情况和脑损伤面积,RT-PCR法观察GDNF mRNA的表达,原位缺口末端标记法(TUNEL)和免疫组织化学染色观察细胞凋亡数及Bax和Bcl-xl蛋白的表达。结果与生理盐水组和BMSCs组相比,GDNF/BMSCs组神经功能恢复更好,脑损伤面积所占比率显著降低,GDNF mRNA表达上调,凋亡细胞数明显下降。在1周和2周时间点,GDNF/BMSCs组与BMSCs组和生理盐水组相比,Bcl-xl阳性细胞数明显增加,而Bax阳性细胞数则减少。结论 GDNF基因修饰的BMSCs移植至脑出血大鼠后,可能通过上调GDNF基因的表达、抑制细胞凋亡、增加Bcl-xl蛋白的表达和降低Bax蛋白的表达发挥神经保护作用。

GDNF基因修饰的BMSCs在脑出血大鼠脑内存活与分化的实验研究

目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在脑出血大鼠脑内的存活与分化。方法:分别将BMSCs/GDNF、BMSCs和生理盐水移植入脑出血大鼠脑内建立不同的实验组,采用Western blot检测各组大鼠GDNF蛋白的表达,DAPI和免疫荧光组织化学染色观察移植细胞在脑内的存活和分化情况。结果:与生理盐水组和BMSCs组相比,BMSCs/GDNF组的GDNF蛋白表达显著上调;与BMSCs组相比,BMSCs/GDNF组的BMSCs存活率增高,神经微丝阳性细胞率上升,但胶质纤维酸性蛋白阳性细胞率无明显变化。结论:GDNF基因修饰有助于BMSCs在脑出血大鼠脑内的存活和向神经元样细胞方向分化。

儿童骨髓基质细胞系免疫细胞化学初步研究

目的 了解儿童骨髓基质细胞的起源、组成及传代过程中的细胞骨架。方法 采用体外培养和免疫细胞化学染色技术 ,观察波形纤维蛋白 (Vimentin)、结蛋白 (Desmin)、α -平滑肌肌动蛋白 (α -SmoothMuscleActin)和VIII因子相关抗原 (VonWillebrandFactor)在儿童骨髓基质细胞系中的表达。结果 Vimentin在原贴壁基质细胞系由原代传至 5代的细胞中 ,其表达逐渐下降 ,而在再贴壁基质细胞传至第 3代中表达最高 ;Desmin、α -SmoothMuscleActin单克隆抗体和VonWillebrandFactor抗体染色呈阴性。结论 本结果提示本文中骨髓基质细胞来源于间充质 ,Vimentin的表达与细胞的分化、增殖有关 ,体外培养时骨髓基质细胞的组成、分化可能与培养条件有关。

GDNF诱导分化骨髓基质细胞对PD大鼠的治疗作用

目的探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)诱导分化骨髓基质细胞(BMSCs)脑内移植对帕金森病(PD)模型的治疗作用。方法体外培养、分离和纯化的BMSCs,用5-溴脱氧尿核苷(BrdU)标记和GDNF诱导分化。分别将经GDNF诱导分化(A组)和未经GDNF诱导分化(B组)的BMSCs移植到PD大鼠模型纹状体区。另设生理盐水对照组(C组)和PD模型对照组(D组)。于不同时间点检测大鼠旋转行为变化,运用免疫荧光组织化学方法分析比较各组纹状体内酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数量。结果①旋转行为检测显示,C组和D组在所有时间点未见明显变化;在移植后7～30 d,A组和B组分别与C组和D组比较,旋转行为明显减少(P<0.05);A组比B组旋转行为减少更为显著(P<0.05)。②免疫荧光组织化学检测显示,A组与B组比较,GFAP和TH阳性细胞数量明显增多(P<0.05)。但各组自身各时程比较数量变化无统计学意义(P>0.05)。结论A组的BMSCs脑内移植有效地改善了PD大鼠模型的旋转行为,提高了移植后TH阳性细胞的数量。

稳定表达GDNF/EGFP融合基因的骨髓基质干细胞对多巴胺能神经元的保护作用

目的 构建GDNF基因修饰的骨髓基质干细胞 ,并观察其对多巴胺能神经元的营养支持作用。方法 应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法从新生小鼠大脑皮层细胞克隆出GDNFcDNA片段 ,以pEGFP C1为载体导入骨髓基质干细胞 (MSCs) ,制备稳定表达GDNF/EGFP融合基因的MSCs工程细胞 ,用联合培养的技术通过倒置显微镜和免疫组织化学的方法观察MSCs和GDNF基因修饰的MSCs工程细胞与多巴胺能神经元的相互作用。 结果 MSCs和GDNF基因修饰的MSCs工程细胞共培养均能促进多巴胺能神经元的存活和生长 ,MSCs工程细胞作用更强。 结论 成功构建了GDNF基因修饰的MSCs工程细胞 ,该细胞对多巴胺能神经元有明显营养保护作用 。

逆转录病毒介导的人血小板生成素(TPO)在骨髓基质细胞中的表达

为探讨逆转录病毒介导的TPO基因在人骨髓基质细胞系HFCL中的表达,利用脂质体法将含TPO基因的逆转录病毒载体导入HF-CL细胞中,RT-PCR和基因组DNA PCR分析证实mRNA水平有表达,基因组中整合有Neo基因和TPO基因。TPO依赖细胞株TD-3检测生物学活性表明转染的骨髓基质细胞分泌TPO。上述结果为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血细胞的调控作用提供了必要的基础资料。

Leustroducsin对人骨髓基质细胞系BM01细胞因子基因表达的作用

应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,观察leustroducsin对人骨髓基质细胞系BM01细胞因子基因表达的影响。结果显示,leustroducsin是白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)的诱导剂,可诱导BM01的IL-6基因表达明显增强。

毕西巴尼、Leustroducsin及Z-100对人骨髓基质细胞株白介素6产生的作用

我们使用Ｌｅｕｓｔｒｏｄｕｃｓｉｎ、毕西巴尼（ＯＫ－４３２）及Ｚ－１００三种细菌制剂作为诱导剂，通过培养人骨髓基质细胞株ＢＭ０１，观察此三种物质对ＢＭ０１白细胞介素６（ＩＬ６）产生的影响，用ＥＬＩＳＡ法检测培养液中ＩＬ６的含量。结果显示，三种诱导剂均可能ＢＭ０１分泌ＩＬ６增多，以Ｌｅｕｓｔｒｏｄｃｓｉｎ的诱导作用最显著。

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的BMSCs移植对脑出血大鼠TrkA表达的影响

目的:观察GDNF基因修饰的BMSCs移植对脑出血大鼠TrkA表达的影响。方法:通过脑立体定位仪向SD大鼠脑尾壳核注射胶原酶和肝素建立脑出血动物模型,并随机将大鼠分为生理盐水组、BMSCs组和BMSCs/GDNF组,各组又根据细胞移植后再喂养时间的不同(1w、2w)分为2个亚组。在脑出血第3d分别注射生理盐水和移植BMSCs及BMSCs/GDNF。采用免疫组织化学和Western blotting方法检测TrkA在大鼠脑组织内的分布与表达水平。结果:免疫组化显示TrkA阳性细胞主要分布于出血灶周边的纹状体、大脑皮质和下丘脑等区域;与生理盐水组相比,BMSCs组在1w和2w时TrkA免疫阳性产物表达明显增高;而BMSCs/GDNF组的TrkA免疫阳性产物表达在1w和2w时均显著高于BMSCs组和生理盐水组。Westernblotting检测也显示出BMSCs/GDNF组的TrkA蛋白表达在1w和2w时均明显高于BMSCs组和生理盐水组。结论:GDNF基因修饰的BMSCs移植能增强TrkA的表达,有利于改善病灶部位及周边区微环境,促进神经组织重塑。

骨髓基质细胞保护药物诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的机制研究

目的研究原代正常骨髓基质细胞对多发性骨髓瘤细胞的保护作用及其内在机制。方法脂质体介导Notch1特异性小干扰RNA转染多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞与骨髓基质细胞共培养,采用细胞形态学观察和流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测Notch1及NF-κB p65蛋白表达变化。结果多发性骨髓瘤细胞与基质细胞共培养增加了Notch1活化形式(N1-ICD)蛋白的表达;共培养组与悬浮培养组药物诱导的细胞凋亡率分别为(15.30±2.21)%、(32.88±3.27)%;小干扰RNA有效的下调Notch1蛋白的表达;干扰共培养组与控制共培养组细胞的凋亡率分别为(41.47±4.01)%和(24.89±3.68)%;下调Notch1后NF-κB p65蛋白表达没有改变。结论骨髓基质细胞保护药物诱导的多发性骨髓瘤细胞的凋亡,该保护作用通过激活Notch1通路实现。下调Notch1共培养恢复药物诱导的凋亡作用不是通过NF-κB通路,可能存在其他机制。

人类骨髓基质细胞系免疫组化标本的制备

采用体外培养技术制作人类骨髓基质细胞系，在８ｃｍ２平皿中制备原代和传代细胞标本，用ＡＢＣ法在皿中直接行Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｄｅｓｍｉｎ、αＳｍｏｏｔｈＭｕｓｃｌｅＡｃｔｉｎ单克隆抗体和ＶｏｎＷｉｌｅｂｒａｎｄＦａｃｔｏｒ抗体染色。结果显示：平皿中细胞分布均匀，无污染、破损和脱片，方法简易，优于盖玻片法，可用于贴壁粘附细胞的免疫组化研究。

胶质细胞源神经营养因子在大鼠骨髓间充质干细胞神经分化中的表达

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)神经分化及胶质细胞源神经营养因子(GDNF)表达的变化。方法体外培养大鼠BMSCs,传至第4代,行神经诱导分化。流式细胞术检测培养细胞表面的骨髓基质细胞标志CD90和造血细胞标志CD45。以10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和(或)10μg/L表皮生长因子(EGF)在含100mL/L胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中诱导,7d后观察其细胞形态变化,免疫组织化学法检测其胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,RT-PCR检测其GDNF及其受体RETmRNA的变化。结果BMSCs能在体外成功培养及纯化,第4代细胞高表达CD90(93.4%),不表达CD45。诱导7d后,实验组大鼠均可见GFAP及NSE表达,而对照组为阴性。实验组中bFGF组及bFGF加EGF组表达的NSE高于EGF组,而EGF组表达GFAP更高。RT-PCR检测示BMSCs向神经细胞诱导后,GDNF表达显著增强,并促使RET基因表达,以bFGF加EGF组最明显。结论bFGF及EGF可促进大鼠BMSCs向神经细胞分化,在向神经细胞分化的过程中,能促进GDNF和RET基因的表达,GDNF可能在BMSCs向神经细胞分化过程中起重要作用。

永生化人骨髓基质干细胞系的生物学特征

[目的]明确永生化人骨髓基质干细胞系MSCxj的生物学特征。[方法]MSCxj细胞在连续体外培养过程中,相差显微镜及透射显微镜观察细胞的形态特征;计算群体倍增时间,测定细胞增殖周期,计算克隆形成率等生长增殖特征并与原代人骨髓基质干细胞BMSCs-2比较。[结果]细胞形态为成纤维细胞样,细胞器发达;群体倍增时间40.8 h,较BMSCs-2的43.82 h短,MSCxj生长增殖活跃;MSCxj克隆形成率10.9%,BMSCs-2为11.5%,具有克隆形成能力。[结论]MSCxj细胞保持了人骨髓基质干细胞的生物学特征。

大鼠骨髓基质干细胞诱导分化为肠神经细胞的体外研究

目的探讨不同方法诱导大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)分化为肠神经细胞的可能性,并探索适宜的诱导方法。方法体外培养并鉴定BMSC,流式细胞法检测CD90和CD45。传代至第6代后行神经诱导分化。先以10ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导24h,然后分2组：胶质细胞源神经营养因子(GDNF)组以10ng/ml GDNF,在胎肠培养基(FGCM)条件下诱导10d；维甲酸组以0．5 mmol/L维甲酸、10μmol/L ZnSO_4和FGCM诱导10d。免疫荧光法检测神经特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、蛋白基因产物(PGP9．5)、一氧化氮合酶(nNOS)和血管活性肠肽(VIP)的表达。所得数据行t检验。结果流式细胞检测BMSC呈高表达,其标志为CD90,而不表达造血细胞标志CD45。诱导10d后,GDNF组和维甲酸组均有部分细胞在形态上表现出神经元样改变,免疫荧光染色NSE、NF、PGP9．5、nNOS、VIP阳性,GFAP阴性。GDNF组NF、PGP9．5、nNOS、VIP阳性比例显著高于维甲酸组(75．6％±8．4％比48．5±7．5％；57．7％±6．5％比35．7％±7．2％；46．6％±5．4％比30．5％±6．6％；72．3％±6．7％比40．4％±7．4％；P＜0．01)。结论在体外BMSC可被诱导分化为肠神经样细胞并表达肠神经递质,GDNF在胎肠培养基条件下诱导肠神经样细胞比例高于维甲酸。