TpbA通过调节c-di-GMP抑制鲍曼不动杆菌ATCC17978生物膜的形成

目的分析生物膜形成相关的酪氨酸磷酸酶A(TpbA)经调节3,5-环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)影响鲍曼不动杆菌ATCC17978生物膜的形成。方法通过上海生工合成TpbA基因序列,构建pET-28a-TpbA载体,原核重组表达目的蛋白TpbA经亲和层析纯化后并用western blot验证,将该载体转入鲍曼不动杆菌ATCC17978,采用western blot和磷酸酶活性实验鉴定TpbA表达及活性,分析c-di-GMP表达水平及生物膜形成情况。结果在成功构建pET-28a-TpbA载体并证实表达TpbA的基础上,将该载体转入鲍曼不动杆菌ATCC17978,western blot表明TpbA过表达(P<0.05),磷酸酶活性实验证实过表达的TpbA具有酶活性(P<0.05)。进一步分析发现,ATCC17978中TpbA过表达能够降低c-di-GMP的水平(P<0.05),表明TpbA能够有效调节鲍曼不动杆菌的c-di-GMP。ATCC17978中c-di-GMP相关的生物膜形成在TpbA过表达作用下能够被显著抑制(P<0.05)。结论本研究初步证实了TpbA通过调节c-di-GMP,可以抑制ATCC17978生物膜形成,为抑制鲍曼不动杆菌生物膜的形成提供了新的潜在靶点和实验数据。

外源性C-di-GMP对变形链球菌产酸、耐酸能力的影响

目的:初步探讨外源性c-di-GMP对变形链球菌产酸、耐酸能力的影响。方法:外源性c-di-GMP与生理盐水分别加入至含变形链球菌UA159菌液的BHI培养基中,比较两组对变形链球菌产酸、耐酸能力的影响。结果:c-di-GMP处理组与生理盐水组相比,产酸、耐酸能力明显下降,差异有统计学意义,经t检验,P<0.05。结论:c-di-GMP可以抑制变形链球菌的产酸、耐酸能力,可以单独也可以与其它的抗龋制剂联合应用控制龋病。

病原细菌受体介导的c-di-GMP信号传导及其调控机制

细菌第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)信号网络系统主要涉及信号代谢、识别、接受、传递、功能表达和调控。c-di-GMP胞内水平受到鸟苷酸环化酶(DGC)和磷酸二酯酶(PDE)的控制。c-di-GMP信号受体类型多样,包括转录调控因子、PilZ结构域蛋白、退化的GGDEF和EAL结构域蛋白、核糖体开关、多核苷酸磷酸化酶和新发现的蛋白激酶等。c-di-GMP受体接受信号后,可以在转录、翻译以及翻译后水平上对下游靶标进行调控,从而影响细菌的毒性、运动性、生物膜形成、细胞分裂等生理生化过程。本文结合本实验室对水稻白叶枯病菌的研究结果,综述了近年来国内外在c-di-GMP信号受体介导的调控机制等方面的研究进展。

环二鸟苷酸(c-di-GMP)作为潜在免疫佐剂的研究进展

环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是在细菌中普遍存在的第二信使分子,参与调节多种生理功能,近年来研究发现环二鸟苷酸作为免疫调节剂作用于真核细胞可产生良好的免疫调节作用,实验研究表明其有可能成为具有潜力的疫苗佐剂。本文综述了c-di-GMP的结构,生物学功能、免疫特性和作为疫苗佐剂研究等方面的最新研究进展。

老年高血压病患者血vWF、GMP-140、CRP含量的研究

目的 :研究老年高血压病 (EH)患者的血管内皮细胞损伤、血小板活化和炎症因子改变。方法 :选择 31例 、 期 EH患者和 2 8例老年正常对照者 ,测定其血浆 v WF因子、α颗粒膜蛋白 - 140 (GMP- 140 )和血清 C反应蛋白 (CRP)含量。结果 :EH组患者血浆 v WF、GMP- 140含量明显高于对照组 ;EH组血浆 v WF含量与收缩压呈正相关。结论 : 、 期老年 EH患者有明显的内皮细胞损伤和血小板活化 ,血管内皮细胞损伤与收缩压呈正相关。

氯吡格雷对不稳定心绞痛患者血清CRP及GMP-140的影响

目的:检测不稳定心绞痛(UA)患者血清CRP(C-反应蛋白),GMP-140(血小板α颗粒膜蛋白-140)的浓度及氯吡格雷对其影响和临床疗效。方法:59例UA患者随机分为常规治疗组29例,氯吡格雷组(在常规治疗基础上加用氯吡格雷首次顿服300 mg,次日起75 mg/d,连服2周)30例,另选正常对照组(无任何治疗)20例。测定59例UA患者治疗前后及20例正常对照者血清CRP,GMP-140浓度。结果:氯吡格雷组临床总有效率(93.3%)优于常规治疗组(72.4%)(P<0.05)。UA患者血清CRP,GMP-140浓度显著高于正常对照组(P<0.01)。治疗后氯吡格雷组和常规治疗组血清CRP,GMP-140浓度均显著下降(P<0.01),且氯吡格雷组下降水平优于常规治疗组(P<0.01)。结论:氯吡格雷可降低UA患者血清CRP,GMP-140浓度,有利于减轻炎症反应,稳定斑块。

2型糖尿病患者GMP-140,PC,Fbg和D-D含量检测的临床意义

目的:探讨2型糖尿病患者检测血小板α-颗粒膜蛋白(GMP-140)。蛋白C(PC),纤维蛋白原(Fbg)和 D二聚体(D-D)含量的临床意义。方法:用 ELISA法和免疫比浊法分别检测,GMP-140、PC、Fbg和D-D含量结果:2型糖尿病患者GMP-140、Fbg和D-D含量明显高于健康年轻人组,而PC明显低于健康年轻人组,与脑梗死患者相同除D-D外,GMP-140、PC和Fbg与健康老年人组比较无显著性差异。结论:糖尿病的治疗应在控制血糖的同时结予抗凝和改善血液循环的治疗,以预防血栓形成。

DN患者血清Cys-C、尿mAlb和血小板GMP-140检测的临床意义

目的:探讨糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)患者血清Cys-C、尿mAlb和血小板GMP-140水平的变化及临床意义。方法:应用放射免疫分析、胶乳增强免疫比浊法和生化法对32例DN患者进行了Cys-C、尿mAlb和血小板GMP-140的检测,并与35名正常健康人作比较。结果:DN患者血清Cys-C和尿液Alb及血小板GMP-140水平均非常显著地高于正常人组(P<0.01),且血清Cys-C水平与尿mAlb、血小板GMP-140水平呈显著正相关(r=0.5642、0.6038,P<0.01)。结论:检测DN患者血清Cys-C、尿mAlb和血小板GMP-140水平的变化对了解病情、观察疗效和预后判断均有重要的临床价值。

美罗培南对胞内不同c-di-GMP浓度表型铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响

目的:探究美罗培南对胞内不同环二鸟苷酸(c-di-GMP)浓度表型铜绿假单胞菌(PA)生物被膜形成的影响。方法:两倍稀释法测定美罗培南对各菌株的抑菌浓度(MIC);设阴性对照组和3个美罗培南干预组(1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC)。用1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC的美罗培南分别干预野生株PAO1、PA胞内c-di-GMP高表达株(PAO1ΔwspF)、PA胞内c-di-GMP低表达株(PAO1/Plac-yhjH),观察美罗培南对其运动能力的影响,用结晶紫染色法测定美罗培南对PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH菌株的生物被膜形成以及对生物被膜清除能力的影响。结果:在美罗培南的干预下,PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH的运动区域直径均比阴性对照组小(P<0.05),所形成的的生物被膜也均比阴性对照组少(P<0. 05),而破坏的生物被膜均比阴性对照组多(P<0. 05)。结论:美罗培南能抑制PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH的运动能力以及生物被膜形成,美罗培南能破坏PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH形成的生物被膜,美罗培南对PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH的抑制效果不同。

水稻白叶枯病菌第二信使c-di-GMP代谢酶基因的预测和分析

旨在从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)中鉴定出含有GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶(DGC)和含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(PDE)编码基因。预测分析了Xoo已测序菌株中的GGDEF、EAL和HD-GYP结构域蛋白的种类、数量及其序列特征,鉴别了基序保守的DGC或PDE、基序退化的信号受体以及信号输入结构域,验证了部分不同类型结构域蛋白作为DGC/PDE、信号受体以及在细菌毒性调控等方面的功能。

c-GMP诱导对盐胁迫下番茄的转录组分析

以市场常见的番茄为材料,采用Illumina高通量测序技术对NaCl胁迫、c-GMP诱导以及两者组合处理下番茄幼苗进行转录组测序。结果表明:共获得83.35 Gb的原始数据,Q30碱基百分比在90.91%及以上,分别将各样品的原始读数与指定的参考基因组进行序列比对,比对效率从88.03%到92.74%不等。同时将得到的31734条序列注释到不同的数据库(GO、KEGG、KOG、NR、Pfam、Swiss-Prot和egg NOG),通过GO数据库,将其划分到细胞组分、分子功能以及生物学过程三大注释类别下的51个亚功能组中,通过COG数据库与KEGG数据库将其分别注释到25个类别与128个代谢通路。在NaCl胁迫、c-GMP诱导以及两者组合处理下共发现SNP位点127944个,其中仅有22.6%的SNP位点位于非编码区。差异基因结果显示,c-GMP能诱导盐胁迫下更多基因的表达。该转录组测序数据可靠,结果覆盖面广,为番茄c-GMP诱导盐胁迫下基因挖掘与功能研究提供了理论依据。

基于RNA适配体检测体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP

旨在建立简单、快速的检测体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP的方法。本研究以含有T7启动子、VC2GEMM-1核糖开关序列或其突变序列VC2/g20a、spinach2和tRNA序列的双链DNA为模板,利用T7RNA聚合酶体外转录体系制备VC2、VC2/g20aRNA适配体。通过检测绿色荧光强度分析RNA适配体对c-di-GMP和cGAMP的结合能力。结果表明,转录得到的RNA经过加热变性、缓慢退火后得到VC2RNA适配体和VC2/g20a RNA适配体,在125mmol·L^(-1 )KCl和30mmol·L^(-1 )MgCl_2溶液中孵育180min的优化结合条件下,VC2适配体与c-di-GMP特异性结合,VC2/g20a适配体与cGAMP特异性结合;c-di-GMP对VC2适配体的半数效应浓度(EC50)为(89±1.7)nmol·L^(-1),cGAMP对VC2/g20a适配体的半数效应浓度为(309±4.5)nmol·L^(-1);VC2和VC2/g20a能够分别检测低至5nmol·L^(-1)和20nmol·L^(-1)的c-di-GMP和cGAMP;并且发现转录的RNA混合物在未纯化的情况下同样能够检测VC0179体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP。这种方法可以简单快速的检测VC0179体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP,并且为研究其他c-di-GMP和cGAMP合成酶活性提供潜在可能。

水稻白叶枯病菌c-di-GMP受体Clpxoo关键结合功能位点的确定

旨在确定水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)c-di-GMP信号受体Clpxoo的关键功能位点。通过对Clpxoo蛋白氨基酸位点基因突变,表达载体构建、蛋白诱导表达及其Ni-NTA Resin亲和层析,进行了Clpxoo及其点突变蛋白的原核表达和产物纯化;通过等温滴定量热法(ITC),检测了Clpxoo及其点突变蛋白与c-di-GMP的结合作用。利用基因定点突变和桥接PCR方法,在优化的诱导表达和纯化条件下,成功地获得了Clpxoo点突变蛋白和与c-di-GMP不发生结合的Clpxoo点突变体。结果表明,Clpxoo蛋白第70位天冬氨酸和第99位谷氨酸是与c-di-GMP结合的关键功能位点。

WspR在大肠杆菌中的表达及其对c-di-GMP合成的影响

可得胶是土壤农杆菌ATCC31749分泌的一种胞外多糖,大多数细菌胞外多糖的合成受控于新近发现的第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP).细胞内c-di-GMP的产生受二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)合成和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)降解两条途径调控.在结构上,通常DGC含有GGDEF结构域,PDE含有EAL结构域.研究表明从绿脓杆菌(P.aeruginosa)中得到的类趋化系统蛋白WspR具有GGDEF结构域,具有DGC活性.本实验将WspR转入大肠杆菌中得到了表达,并用颜色反应得到证实c-di-GMP在E.coli大量合成.为进一步研究ATCC31749中WspR的作用机制,促进可得胶的合成提供切实可行的依据.

c-di-GMP在低温好氧颗粒污泥形成过程中的作用

在低温条件下运行好氧颗粒污泥反应器,絮状污泥颗粒化过程中信号分子可通过传导作用引起各层物质之间的组分变化,通过研究胞外聚合物及污泥相关疏水性的变化规律,并观察此过程中微生物菌群的群落演替特点,揭示环二鸟苷酸(c-di-GMP)在低温好氧颗粒污泥形成过程中的变化规律与影响作用.结果表明:接种污泥在颗粒化过程中,胞外聚合物含量从48mg/gMLVSS增长至139mg/gMLVSS,其中以TB层蛋白质增长为主,在颗粒化过程中,c-di-GMP含量由62?g/gMLVSS增至600?g/gMLVSS,始终影响微生物运动及生物膜形成,促使具备胞外聚合物分泌功能的菌群加快分泌胞外聚合物,促进好氧颗粒污泥的形成.各个阶段污泥中微生物种群存在较大差异,在反应器运行初始阶段与c-di-GMP合成相关的菌群占据优势,同时在后期表现出较好的脱氮除磷能力,在低温条件下好氧颗粒污泥微生物菌群发生演替并最终形成稳定的菌群结构.

氨基酸代谢变化引起的c-di-GMP稳态波动对大肠杆菌致病过程中菌毛合成的影响

[目的]细菌能够合成多种信号分子,调控自身在各种营养状态或应激条件下的生长代谢及毒力发挥。第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)在致病菌感应氨基酸饥饿(AAS)的过程中发挥重要作用,调控多种生理活动并显著影响其毒力发挥。本文旨在研究c-di-GMP在尿道致病性大肠杆菌(UPEC)尿道定殖及毒力发挥过程中的作用。[方法]采用尿液培养UPEC,结合转座子突变技术筛选氨基酸代谢相关生长缺陷基因,采用基因敲除技术、特定氨基酸回补及小鼠尿道感染模型验证尿液生长及尿道定殖缺陷表型;借助表达谱数据、RT-qPCR及β-半乳糖苷酶活性测定法筛选并鉴定受氨基酸饥饿影响的毒力基因及c-di-GMP相关基因;通过多基因敲除及回补技术、凝胶阻滞试验(EMSA)鉴定c-di-GMP对毒力基因的调控机制。[结果]精氨酸、异亮氨酸及蛋氨酸代谢失衡引起UPEC在尿液中生长缺陷,尿道定殖能力显著下降及局部c-di-GMP稳态破坏;YciR及YcgF相关c-di-GMP体系失衡显著下调菌毛基因簇表达;YciR通过调节子MlrA直接调控P菌毛基因簇表达;YcgF通过下游配对调节子YcgE直接调控P菌毛基因簇表达。[结论]c-di-GMP感应尿道定殖过程中的特定氨基酸饥饿,调控菌毛等黏附因子合成,促进UPEC完整毒力发挥。

hs-CRP、GMP-140和cTnI联检在CHD患者的应用

目的:探讨了超敏C反应蛋白(hs-CRP)、颗粒膜蛋白-140(GMP-140)和肌钙蛋白T(cTnI)水平的变化与冠心病(CHD)患者的关系及临床价值。方法:应用放射免疫分析、酶联法和免疫比浊法对91例CHD患者进行了血清hs-CRP、GMP-140和cTnI测定,其中稳定型心绞痛(SAP)42例,不稳定型心绞痛(UAP)34例,急性心梗死(AMI)15例,并与35名正常人作比较。结果:CHD患者血清hs-CRP、GMP-140和cTnI水平均非常显著地高于正常人组(P<0.01),急性AMI组和UAP组均高于SAP组(P<0.05),且血清hs-CRP水平与GMP-140、cTnI水平呈正相关(r=0.6214、0.6023,P<0.01)。结论:检测CHD患者血清hs-CRP、GMP-140和cTnI水平的变化及CHD的发生和发展以及疗效和预后观察具有重要的临床意义。

一种基于TTP/C协议的容错策略研究

组成员协议(GMP)是基于TTP/C的一种软件容错策略。在传统的GMP策略中,故障的节点都会将自己从本地成员表中删除,在有n个节点的系统中,出现(n-3)次连续的故障后,可能会导致GMP策略无效。研究了一种新型的GMP容错策略,可对瞬态故障的节点进行恢复,使其在(3n+1)个时间段内重新返回到系统中,增强了系统的容错鲁棒性。

Zynq平台的TTP/C总线控制器容错算法设计

在自主设计的TTP/C总线控制器中,充分利用Zynq芯片的可编程逻辑单元和程序处理单元,设计了一种基于成员关系协议(GMP)的容错算法,以快速检测与隔离总线集群中的故障节点。试验表明,所设计的容错算法能有效检测并隔离总线集群中的故障节点。

变形链球菌gcp基因敲除菌株表达谱基因芯片

背景:前期研究中经证实变形链球菌内部存在单磷酸鸟苷环二聚体信号通路,构建了变形链球菌 gcp 基因敲除菌株。目的:比较变形链球菌野生菌种和 gcp 基因突变菌株基因表达的差异情况,筛选与生物膜相关的基因,进入后续研究。方法:提取两种细菌的总 RNA,反转录后分别用 cy3 和 cy5 染色。与基因芯片杂交后,扫描结果,进行数据分析,获取差异基因信息,对筛选的基因进行 Real-Time PCR 验证。结果与结论:差异基因主要与糖代谢、生物膜形成有关,选择了 2 个基因进行验证,PCR 结果与芯片结果相符合。变形链球菌 gcp 基因敲除后,突变菌株 ahpC 基因表达上调,磷酸转移酶系统基因表达下调,说明这 2个基因与 c-di-GMP 信号通路的下游途径相关。