应用cDNA微矩阵基因芯片筛选运动性心肌肥大相关基因的初步研究

目的 :应用cDNAchip(cDNA芯片或微矩阵基因芯片 )技术筛选运动性心肌肥大相关基因。方法 :摘取运动组和对照组小鼠心脏 ,按一步法抽提总RNA并纯化mRNA ,将 2 30 4个点包括10 3个阴性及对照基因和 2 2 0 1条小鼠靶基因的PCR扩增产物 ,按微矩阵 (12× 12点× 16亚矩阵 ,点间距离 375 μm)点制于硅烷化玻片上 ,制备成cDNA芯片。将等量抽提纯化的运动组和对照组小鼠心肌组织mRNA ,分别与掺入的荧光分子Cy3和Cy5经逆转录合成cDNA荧光探针 ,混合后再与cD NA芯片杂交 ,通过芯片扫描仪对荧光信号图像进行扫描 ,经计算机分析比较运动组和安静对照组心肌组织中基因表达谱的变化。结果 :在 2 2 0 1条待研究基因中 ,两组小鼠心肌组织间存在差异表达的基因。具有显著表达差异的基因有 71条 ,其中上调基因有 37条 ,下调基因有 34条。结果显示 :cDNA芯片技术筛选运动性心肌肥大相关基因具有高通量、高敏度、高效率、大规模和并行性等优点。

用cDNA芯片检测大鼠心肌缺血预适应后基因表达谱的改变

为了检测缺血预适应后大鼠心肌基因表达谱的改变 ,采用cDNA芯片方法对缺血预适应后大鼠心肌基因谱的改变进行检测。结果发现 ,缺血预适应大鼠心肌中差异表达基因共 75项 ,其中表达上调基因 4 8项 ,表达下调基因 2 7项。采用逆转录—聚合酶链反应进一步验证了cDNA芯片结果的可靠性 ,并初步分析了基因表达谱改变在缺血预适应诱导的心肌内源性保护作用中有一定意义。以上研究有助于从基因水平阐明缺血预适应诱导的心肌保护的分子机制 ,为临床防治缺血 再灌注损伤及缺血性心脏疾病提供新的思路。

应用cDNA芯片分析79个新基因的人胚组织表达谱

大规模cDNA测序和生物信息学技术相结合 ,得到来自于商品化的人胚肾cDNA文库 79个代表新基因的表达序列标签 (EST) .随后 ,采用高速度机械手制备这些cDNA的基因芯片 ,用于鉴定 79个新基因的ESTs在2 0周、 2 6周两个胚胎时期 6种组织中的基因表达状况 ,以研究这些EST片段代表的新基因功能提供线索 .通过芯片杂交及结果分析 ,得到同一个组织两个不同时相 8个差异表达的基因 。

cDNA芯片结合抑制性差减杂交技术构建对虾白斑综合征病毒表达基因和螯虾免疫相关基因文库

以克氏原螯虾做为对虾白斑综合征病毒(WSSV)的增殖模型,试验组接种WSSV,对照组接种PBS。分别以试验组为检测组(tester)、对照组为驱逐组(driver),进行正向抑制性差减杂交;以对照组为tester、试验组为driver,进行反向SSH。将获得的正、反向差减杂交产物克隆入质粒载体PinPointTM Xa-1T-Vector,再转化大肠杆菌DH5α,共构建了2个分别含1620和400个克隆的正、反向差减文库。经PCR扩增,1514个差减克隆得到产物,其中正向差减克隆1221个,反向差减克隆293个。获得的PCR产物经浓缩、变性处理,用自动点样仪点制于尼龙膜载体上,制成cDNA芯片,用cDNA芯片对SSH获得的差减克隆进行鉴定,共获得差异表达克隆278个,其中攻毒组高表达克隆255个;对照组高表达克隆23个。

cDNA芯片表面核酸固定化的优化

cDNA芯片技术表面核酸固定化影响因素众多 ,其中涉及选择载体、固定于玻片的DNA片段浓度、玻片DNA片段的固定方法、玻片预处理方法、DNA片段的变性、溶解DNA片段的点样液等等 .针对这些因素进行了优化筛选实验 ,以便于提高cDNA芯片技术检测基因表达的效率 .

cDNA芯片技术杂交效率的优化

目的 cDNA芯片杂交影响因素很多 ,如固定于玻片的DNA片段的浓度、溶解DNA片段的点样液、荧光探针浓度及纯度杂交液、杂交温度、杂交时间和Cy3与Cy5荧光素标记探针等 ,本实验针对其中重要影响因素进行优化筛选 ,以提高杂交效率。方法 通过逐一改变cDNA杂交技术重要影响因素的实验条件 ,平行设置多组实验 ,从中筛选出最佳实验数据。结果与结论 重复实验结果表明 ,杂交效率较高的条件为 :浓度约为 0 5 0 μg·μL- 1 DNA片段 ,溶于 1×MicroSpottingSolution(ArrayItTM)中 ,与纯化后的荧光标记在 0 5 %SDS 10×SSC甲酰胺杂交液 ,在 4

用cDNA芯片技术快速鉴定鼻咽癌组织消减文库中的差异基因

迅速分离、鉴定鼻咽癌组织中差异表达基因是研究其发生、发展分子机制的基础．先用正常鼻咽组织和鼻咽癌组织进行抑制性消减杂交，构建了消减文库再用含有 １４ ０００个基因片段的ｃＤＮＡ芯片，对此库进行了筛选，结果发现了４１７个差异表达的基因，其中在鼻咽癌组织中上调的１７０个，下调的２４７个．抑制性消减杂交提供了一个差异基因的富集库，而利用ｃＤＮＡ芯片同时筛选上万个基因；

采用cDNA芯片检测Krüppel样因子4过表达对C_2C_(12)细胞基因表达谱的影响

目的采用cDNA芯片检测Krüppel样因子4过表达对C2C12细胞中基因表达谱的影响。方法用cDNA芯片检测Krüppel样因子4过表达的C2C12细胞中基因表达谱的改变(以空载体细胞为对照);用MEDLINE、Genomatix等生物信息学数据库和分析软件对在Krüppel样因子4过表达的C2C12细胞中表达发生改变的已命名基因进行功能和细胞信号通路分析。结果采用cDNA芯片筛选到在Krüppel样因子4过表达的C2C12细胞中表达发生改变的基因605个;其中下调的基因为250个,已命名基因为155个;上调的基因为355个,已命名基因为255个;其中包含多个炎症相关基因和凋亡相关基因。上述炎症相关基因属于13条细胞信号通路,凋亡相关基因属于9条细胞信号通路。结论Krüppel样因子4过表达能够引起C2C12细胞中多个下游基因表达发生改变。

EBV病毒全基因组cDNA探针的设计与制备(英文)

目的设计和克隆所有EB病毒(EBV)已知和预计的编码基因作为cDNA探针用于构建EBV微阵列,以促进研究EBV在其相关疾病中的发病学作用.方法cDNA探针首先由Oligo6.0,Blast和Primer Primier软件设计和筛选全 EBV基因组探针,它们的长度被定在300～600 mer并且具有高度特异性.从B95-8细胞和NPC组织的基因组DNA和 RNA中,通过PCR和RT-PCR方法扩增这些探针,之后克隆入T/A克隆载体.所有的探针被测序鉴定.结果除LF1和LF3基因在B95-8细胞的EBV基因组中不存在外,其余85个基因片段(BWRFl基因有7个重复阅读框架)和两个EBERs基因被成功克隆.结论EBV cDNA探针的设计和克隆为制备EBV微阵列和进一步研究EBV基因组在其相关疾病中的作用奠定了基础.

检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的构建

猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)是三种常见的仔猪病毒性腹泻病原,作者拟构建可同时检测三种病原的cDNA基因芯片。分别根据PEDV基因(S、M)、TGEV基因(S、N)、PoRV基因(VP7、NSP4)的保守区设计引物扩增靶基因,进行PEDV-TGEV-PoRV的cDNA阵列设计,建立了扩增标记探针的多重PCR方法,并对所构建cDNA芯片的特异性、灵敏性、重复性进行了评价。确定了该cDNA芯片的阳性判断标准:SNR大于或等于2.0(或信号强度中位值大于等于1 500)。PEDV-TGEV-PoRV诊断cDNA芯片具有良好的特异性,该芯片不与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒发生交叉反应;芯片的最低检测质量浓度为20pg·μL-1;同一张芯片可重复使用至少7次。本研究为鉴别三种仔猪病毒性病的鉴别诊断提供了新的高通量检测技术。

cDNA芯片重复探针检测值的一致性分析

通过SOURCE数据库对4套cDNA数据的探针进行了注释,分析了对应同一条Unigene的多个探针的检测值(即重复检测值)之间的相关性。采用两种常规方法处理了重复检测值,比较了这两种处理方法对筛选差异表达基因的影响。结果显示:Unigene的重复检测值之间存在一定比例的负相关;更新探针注释数据后的重复检测值之间的低相关比例减少,高相关比例显著提高;重复点样探针之间的相关性高于其它重复检测值,但是仍有很多低相关;两种处理重复检测值方法对于用基因表达差异显著性分析方法(SAM)与T检验方法筛选差异表达基因影响不大。

脾气虚证免疫相关基因组学机制初探

目的采用cDNA芯片技术,探讨脾气虚证免疫功能的异常变化,并揭示其发生的基因组学机制。方法分别提取脾气虚证慢性胃炎与溃疡性结肠炎患者(6例)以及健康人(3名)外周血白细胞总RNA ,mRNA微量扩增,制成杂交探针;脾气虚证慢性胃炎与溃疡性结肠炎患者分别用Cy3标记,健康人用Cy5标记。标记好的Cy3、Cy5探针等量混匀后与cDNA芯片杂交。扫描仪扫描芯片荧光信号,处理、分析数据。分别比较脾气虚证慢性胃炎与溃疡性结肠炎患者同健康人外周血白细胞中免疫相关基因表达水平的差异。结果脾气虚证慢性胃炎与溃疡性结肠炎患者外周血白细胞中CD9、CD16 4、PF4、RARB基因表达下调,IGKC、DEFA1、GNLY基因表达上调。结论脾气虚证发生有免疫相关基因组学基础,脾虚时机体免疫功能紊乱。

淡色库蚊细胞色素P450抗性相关基因克隆与初步鉴定

[目的 ]探讨淡色库蚊细胞色素P45 0与溴氰菊酯抗药性的关系。 [方法 ]采用一对昆虫细胞色素P45 0简并引物 ,以反转录 聚合酶链反应从淡色库蚊扩增特异片段 ,T/A直接克隆法筛选阳性克隆 ,对新序列进行cDNA芯片和逆Northern分析。 [结果 ]从淡色库蚊对溴氰菊酯敏感品系和抗性品系获得 112个阳性克隆 ,其中 2 4个阳性克隆测序后显示为细胞色素P45 0新序列 ,由GenBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定分别属CYP4家族CYP4C、CYP4D、CYP4H和CYP4J等 4个亚家族 ;2 4个CYP4cDNA片段中 ,来自敏感品系的 2个片段(NYDS3和NYDS5 )和来自抗性品系的 4个片段 (NYDR6、NYDR9、NYDR15和NYDR17)在两品系间存在差别 ,cDNA芯片信号亮度值均是抗性品系大于敏感品系 ,倍数在 3 .1～ 9.7范围内 ;NYDR17仅与抗性探针杂交 ;逆Northern再鉴定 ,获得了与cDNA芯片一致的结果。 [结论 ]淡色库蚊CYP4与溴氰菊酯抗性相关 ;在淡色库蚊溴氰菊酯抗性机理中 ,可能存在P45 0基因点突变而导致的特异表达。

多发性骨髓瘤的基因表达谱分析

目的 :研究MM患者与正常人骨髓基因的差异表达。方法 :应用cDNA芯片技术对 1 0例初诊多发性骨髓 (MM)患者和 1 0名正常骨髓的单个核细胞的mRNA进行检测。结果 :在 2 0 4 8条基因中共发现差异表达基因5 6 6条。在MM中 2 37条表达增加 ,32 9条表达降低。结论 :MM的发生发展涉及多基因的改变 。

细胞周期蛋白E2基因的过度表达与胃腺癌细胞迁徙的关系

从基因芯片筛选出差异表达的基因中一个细胞周期蛋白 (cyclin)E2基因 ,深入研究周期蛋白E2在高转移性胃腺癌细胞系RF 4 8细胞中的生物学作用 .首先通过合成硫代磷酸化修饰的反义、正义和错配寡核苷酸片段 ,使用半定量RT PCR和Western印迹方法分别检测被 3种寡核苷酸转染的RF 4 8细胞在 1～ 5d内周期蛋白E2基因及它可能调控下游靶基因之一FGFR基因和蛋白质的表达 ,检测寡核苷酸转染的RF 4 8细胞周期和凋亡细胞 ,观察寡核苷酸转染RF 4 8细胞的软琼脂集落形成、运动能力和体外侵袭能力 .结果表明 ,修饰的反义寡核苷酸在有效地抑制RF 4 8细胞中周期蛋白E2表达上调后 ,RF 4 8细胞的迁徙能力被显著降低 ,其增殖、运动能力没有变化 .周期蛋白E2基因的主要作用并不是促细胞分裂 ,也与细胞的增殖、运动能力无关 ,周期蛋白E2基因的过度表达与胃腺癌的迁徙性存在相关性 ,其触发肿瘤的侵袭性可能通过某种机制调控其下游靶基因之一成纤维细胞生长因子受体 (FGFR)

转ARL-1基因HepG2细胞耐药相关基因的筛选

背景与目的:醛糖还原酶相似基因1(aldose-reductaselikegene-1,ARL-1)在原发性肝癌中高表达,与肝癌细胞对化疗药物耐药有关。本研究拟建立转染ARL-1的人肝癌细胞株,观察转染ARL-1的HepG2细胞对含醛基抗肿瘤药物耐药性的改变,利用基因表达谱芯片筛选HepG2细胞转染ARL-1后差异表达耐药相关基因。方法:采用脂质体转染PBK/ARL-1质粒到HepG2细胞,获得高表达ARL-1的单克隆细胞株;RT-PCR、流式免疫荧光和免疫组化鉴定高表达ARL-1的HepG2细胞;应用MTT法和细胞凋亡分析研究HepG2细胞和转染ARL-1的HepG2细胞对含醛基抗肿瘤药物阿霉素(ADM)和丝裂霉素(MMC)的耐药性,以5-氟尿嘧啶(5-FU)(不含醛基)为对照;将Cy3和Cy5两种荧光染料分别标记两种细胞的cDNA探针,与人肝癌基因表达谱芯片进行杂交与扫描,观察转染ARL-1基因HepG2与对照组HepG2细胞在基因表达谱方面的差异,筛选耐药相关基因,并运用RT-PCR和Westernblot对部分差异表达相关基因进行初步证实。结果:与对照组HepG2细胞相比,转染ARL-1基因HepG2细胞高表达ARL-1蛋白,明显增强对含醛基的抗肿瘤药物如ADM、MMC的耐药性,分别提高2.6倍和3.47倍,用5-FU处理两组细胞,则未发现有明显的耐药差异(ADM组t=6.39,P<0.05;MMC组t=30.06,P<0.01;5-FU组t=0.684,P>0.05);芯片扫描结?

5个不同肺癌细胞株的基因差异表达谱

目的 :希望获得细胞间基因表达的异同 ,对癌细胞的形成和发展中基因参与提供分析线索。方法 :选用 5个不同转移潜能及来源的体外培养肺癌细胞株H12 99,HLAMP ,PAa ,PGCL3和NiS作为研究对象 ,以永生化的支气管上皮细胞 16HBE为对照 ,采用含有 80 0个基因探针的肺癌相关基因芯片LUs,研究了基因表达的差异。结果 :5个肺癌细胞株差异表达的基因共有 35 5个 ,但共同上调或下调的基因仅有 4个 ,基因表达的变化在不同细胞株之间明显表现出多态性。比较三个高转移细胞株和两个低转移细胞株 ,有 12个基因表达改变出现在高转移细胞株而在低转移株未见明显变化 ,其中有 3个已报道的转移相关基因和 9个未报道和转移相关的基因 ,这些基因大多是膜蛋白、细胞骨架蛋白或 /和细胞信号转导有关 ,基因功能复习提示和肿瘤转移有可能的关联性。结论 :cDNA芯片对于肺癌相关基因的筛选是一个非常有效的研究手段 ;对于临床诊断应用 ,需要在大规模数据收集的基础上建立必要的模式 ,通过多基因系统分析 ,才能获得有效的应用。

神经母细胞瘤恶性进展相关基因初步筛选及验证

目的利用神经母细胞瘤(NB)临床标本筛选与恶性进展相关的基因。方法利用比较基因组杂交技术和表达谱基因芯片技术筛选人类17号染色体上某些区域可能存在的与NB密切相关的候选基因,并结合生物信息学分析和RT-PCR检测结果对候选基因进行进一步鉴定。结果通过初步筛选,在人类17号染色体增添区域发现了与NB恶性进展相关的新基因(ncRAN),该基因包含2个剪切体,Nbla10727和Nbla12061。ncRAN在各组织中及MYCN单/多拷贝组细胞中呈现差异性表达,其高表达与不良预后密切相关(P=0.000 221)。结论在17号染色体增添区所鉴定的新基因很可能是1个与NB恶性进展密切相关的癌基因。

D-半乳糖导致小鼠海马基因表达谱变化

本实验采用cDNA芯片研究D-半乳糖皮下注射小鼠海马的基因表达变化。小鼠皮下注射D-半乳糖[5 0mg/ (kg.d) ]6 0d造模 ,Morris水迷宫测试小鼠行为 ,分别提取模型组和对照组海马组织总RNA ,掺入荧光分子Cy3和Cy5 ,经逆转录合成cDNA荧光探针与 4 0 0 0点小鼠cDNA基因芯片杂交。结果显示 ,在 4 0 0 0条待研究的基因中 ,两组小鼠海马间存在 2倍表达差异的有 76条 ,其中上调 2 6条 ,下调 5 0条。经分析 ,模型组基因表达谱与老年性痴呆 (AD)相关基因表达谱在氧应激、能量代谢相关基因等方面有相似之处。提示D

干旱胁迫下大豆幼苗根系基因的表达谱分析

【目的】了解干旱胁迫下大豆幼苗根系的抗旱机制。【方法】利用基因芯片技术,分析在不同干旱胁迫时间下强抗旱品种晋豆23幼苗根部基因的表达情况。【结果】获得了61171个大豆根系基因的差异表达动态图谱。在不同干旱胁迫时间下根部基因的表达发生变化,3个时间点下,下调表达的基因数量均多于上调表达的基因数量。同时对杂交数据进行多种聚类分析。利用实时荧光定量PCR验证4个基因在干旱胁迫条件下的差异表达,其结果和芯片杂交分析的结果基本一致。【结论】初步建立了大豆幼苗根系干旱胁迫应答基因的动态表达谱,并通过其动态表达了解植物与逆境的互作机制,比较全面地获得了干旱胁迫应答基因,从而更完整地揭示了大豆干旱胁迫应答基因的表达情况。