大鼠carabin腺病毒干扰载体构建及功能鉴定

目的:构建高滴度大鼠carabin腺病毒干扰载体(Ad-carabin-shRNA)。方法:设计3对carabin-shRNA寡核苷酸序列,分别构建3个ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA腺病毒穿梭质粒,将构建好的ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA和pHBAd-BHG质粒共转染293A细胞,以包装Ad-carabin-shRNA,采用微量全细胞病变法检测病毒滴度。Ad-carabin-shRNA感染H9C2心肌细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting检测carabin mRNA及蛋白表达。结果:3个ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA干扰质粒构建成功,相对应的Ad-carabin-shRNA包装顺利,病毒滴度均为9×108 TU/mL。感染H9C2心肌细胞后,Ad-carabin-shRNA-1和Ad-carabin-shRNA-2均有显著干扰效果,carabin mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.01)。结论:Ad-carabin-shRNA构建成功,在心肌细胞中具有干扰carabin的效应。

人TBC1D10C基因过表达慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建人TBC1D10C(hTBC1D10C)基因过表达慢病毒载体,并对其进行功能鉴定。方法利用PCR技术扩增hTBC1D10C基因片段,构建pLVX-hTBC1D10C-mCMVZsGreen-PGK-Puro过表达载体质粒,将构建的过表达载体质粒和系统包装质粒应用高效转染试剂盒转染至293T细胞,以包装rLV-hTBC1D10C-zpp,在HEK293细胞中检测病毒滴度。rLV-hTBC1D10C-zpp感染H9C2心肌细胞,蛋白免疫印迹法检测hTBC1D10C蛋白表达。结果 pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro过表达质粒构建成功,rLV-hTBC1D10C-zpp包装顺利,滴度为1×10^8 TU/ml,感染H9C2心肌细胞后,hTBC1D10C蛋白表达上调(P<0.05)。结论 rLV-hTBC1D10C-zpp构建成功,在心肌细胞中具有高效表达hTBC1D10C的效应。

人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体构建及其稳定表达细胞株的筛选

构建并鉴定人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体,筛选CARABIN过表达的弥散性大B淋巴瘤细胞SUDHL-6的稳定细胞株。通过设计Carabin上下游引物,用同源重组的方法构建慢病毒载体pLENTI-c GFP-CARABIN,将其与psPAX2和pMD2.G包装质粒按3∶2∶1的比例用PEI Transfection Reagent共转染HEK293T细胞制备病毒,用病毒颗粒感染SU-DHL-6细胞2周后,用流式细胞仪分选GFP表达阳性的细胞,Western Blot检测CARABIN-GFP融合蛋白表达。成功构建pLENTI-c GFP-CARABIN慢病毒过表达载体。包装病毒颗粒并感染SU-DHL-6细胞后,荧光显微镜检测和流式细胞分选鉴定表达效率为26.5%,筛选出的GFP阳性细胞用Western Blot检测到CARABINGFP融合蛋白表达。成功构建了Carabin过表达慢病毒载体并筛选出了CARABIN-GFP稳定表达的细胞株。

Carabin过表达对人心室肌细胞AC16氧糖剥夺后凋亡的影响

目的 探讨Carabin基因过表达对氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）诱导的人心室肌细胞株AC16凋亡的作用。方法 构建Carabin过表达及空载稳定细胞株,将AC16细胞分为空载常氧组、Carabin过表达常氧组、空载OGD 24 h组和Carabin过表达OGD 24 h组。空载常氧组及Carabin过表达常氧组置于正常条件下培养;空载OGD 24 h组和Carabin过表达OGD 24 h组置于Hanks液中放入缺氧恒温细胞培养箱培养24 h（1%O2-5%CO2-94%N2）。采用倒置显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术检测心肌细胞凋亡率及存活率; TUNEL染色检测细胞凋亡情况;通过酶标仪检测心肌细胞凋亡蛋白酶Caspase-3和心肌细胞损伤标志物LDH的活性; Western blot检测细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达水平。结果 AC16细胞OGD 24 h后,细胞内Carabin的mRNA及蛋白水平显著降低。与空载常氧组比较,空载OGD 24 h组及Carabin过表达OGD 24 h组的细胞凋亡率、Caspase-3活性、LDH活性及Caspase-3蛋白表达水平均显著升高（P 〈0. 05）。与空载OGD 24 h组比较,Carabin过表达OGD 24 h组的细胞凋亡率、Caspase-3活性、LDH活性及Caspase-3蛋白表达水平显著降低（P 〈0. 05）。结论 Carabin过表达能显著减轻OGD诱导后AC16细胞的凋亡。

人Carabin基因过表达的9型重组腺相关病毒的构建及功能鉴定

目的:构建人Carabin基因过表达的9型重组腺相关病毒,并对其进行结构和功能鉴定。方法:对目的基因质粒pUC57-carabin和载体质粒pAAV9-IRES-ZsGreen进行EcoRI+XhoI双酶切,在T4DNA Ligase作用下连接酶切产物,在JM109感受态细胞中筛选pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen质粒,将pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen质粒应用高效HET kit转染试剂盒转染至293AAV细胞,以包装rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen腺相关病毒,利用Q-PCR检测病毒滴度。rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen感染人心室肌细胞株AC16,western blot检测carabin蛋白表达。结果:pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen过表达质粒构建成功,rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen腺相关病毒包装顺利,滴度为5.09E+12 vg/mL,感染AC16后,carabin蛋白表达显著上调。结论:rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen腺相关病毒构建成功,并在心肌细胞中具有高效表达carabin的效应。

吲达帕胺联合氨氯地平对冠心病患者血清Carabin蛋白、心电图及心绞痛发作的影响

目的:探讨吲达帕胺联合氨氯地平在治疗冠心病患者中的疗效。方法:选择2016年2月至2017年4月在四川省达州市中西医结合医院心内科就诊的冠心病不稳定性心绞痛患者90例,采用随机数字表法分为对照组和观察组,每组45例。对照组服用硝苯地平缓释片,观察组给予吲达帕胺联合氨氯地平治疗,两组均治疗6周。比较两组血清Carabin表达、心绞痛发作次数、心电图疗效,并观察两组在治疗中的不良反应。结果:治疗6周后,观察组冠心病心电图疗效优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。6个月后,与治疗前比较,两组患者血清Carabin蛋白表达、心绞痛发作次数均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),观察组Carabin表达、心绞痛发作次数低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:吲达帕胺联合氨氯地平可提升冠心病患者的疗效,减少心绞痛的发作并改善心肌损伤。