小鼠c-Kit^+lin-骨髓细胞移植生成肝细胞的实验研究

目的评价小鼠c-Kit+Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能,为骨髓源性肝干细胞的临床运用提供可行性实验依据。方法供体为纯系BALB/C雄性小鼠,c-Kit+Lin-骨髓细胞采用免疫磁珠分选法分离细胞。受体为行35Gy全肝照射处理后的同龄同系BALB/C雌性小鼠,立即移植供体c-Kit+lin-骨髓细胞。接受c-Kit+lin-骨髓细胞移植1月后,活杀取肝做常规病理学检查、Y染色体的原位杂交检查、甲胎蛋白与白蛋白的免疫组化检测。结果移植1月后小鼠肝脏的组织结构已恢复正常,肝组织细胞中存在原位杂交和免疫组化均呈阳性反应的双阳性细胞。结论小鼠c-Kit+Lin-骨髓细胞具有肝干细胞潜能,移植后可以在肝内定居并分化形成肝细胞。可做为肝病细胞移植疗法的种子细胞。

不同细胞因子组合对c-kit^+Lin^-细胞的体外扩增研究

目的探讨在无血清无基质条件下,不同细胞因子组合对c-kit+Lin-细胞增殖效应以及最佳扩增时间。方法采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓c-kit+Lin-细胞,将干细胞因子(stem cell factor,SCF),FLt-3配基(FLt-3 ligand,FL),血小板生成素(thrombopoietin,TPO),白细胞介素-3(interleukin,IL-3),肝细胞生长因子(hepatocyte graoth factor,HGF)等细胞因子进行不同组合,体外扩增干细胞14d,于不同时间检测细胞总数和c-kit+Lin-细胞数及比例,并在第10天通过细胞凋亡早期膜变化标记FIFT-Annexin-V,检测细胞凋亡率。结果各组细胞因子均能显著扩增c-kit+Lin-细胞,扩增倍数3～19倍不等。在SCF+FL+TPO中加入IL-3或HGF,其效果更明显,c-kit+Lin-细胞在第6天分别扩增4.71和5.15倍,当同时加入时,两者有协同作用。其中SCF+FL+TPO+IL-3+HGF在第10天扩增程度最为显著,并且凋亡率最低为6.59%。结论在体外短期培养过程中上SCF+FL+TPO+IL-3+HGF组合能产生大量的c-kit+Lin-细胞,并且最佳培养时期为第10天,为肝干细胞提供种子细胞。

肝细胞生长因子对c-kit^+Lin^-细胞的增殖作用

目的探讨在无血清无基质的条件下,肝细胞生长因子(HGF)和因子组合对扩增c-kit+Lin-细胞的影响。方法采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓c-kit+Lin-细胞,研究在干细胞因子(SCF),FLt-3配基(FL),促血小板生成素(TPO)和白血病抑制因子(LIF)组合中添加不同浓度的HGF培养7d,检测细胞总数,c-kit+Lin-细胞扩增倍数及细胞凋亡率。结果各因子组均可显著扩增c-kit+Lin-细胞,扩增倍数2￣8倍不等。其中,10ng/mlHGF组扩增c-kit+Lin-细胞效果最为显著,为8.00倍,细胞总数扩增45.43倍,细胞凋亡率为17.42%。但随剂量加大,虽然细胞总数上升,c-kit+Lin-细胞扩增反而下降。40ng/ml组细胞总数扩增80.50倍,c-kit+Lin-细胞扩增效果不明显,仅为2.87倍,细胞凋亡率最低,为5.91%。结论10ng/ml的HGF能协同SCF+FL+TPO+LIF扩增c-kit+Lin-细胞,使细胞凋亡率降低,其表型并不受影响,但过高剂量会诱导其分化。

白细胞介素3对c-kit^+Lin^-细胞的增殖作用

目的探讨在无血清无基质的条件下,白细胞介素3(IL-3)和因子组合的不同浓度对扩增c-kit+Lin-细胞的影响。方法采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓c-kit+Lin-细胞,在干细胞因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)、FLt-3配基(FL)、促血小板生成素(TPO)和白血病抑制因子(LIF)组合中添加不同浓度的IL-3培养7d,检测细胞总数、c-kit+Lin-细胞扩增倍数及细胞凋亡率。结果未加IL-3(A组),10ng/mlIL-3(B组),20ng/mlIL-3(C组)和40ng/mlIL-3组(D组)均可显著扩增c-kit+Lin-细胞,扩增倍数7～19倍不等。随剂量加大,虽然细胞总数上升,但是超过一定浓度后c-kit+Lin--细胞扩增反而不明显。D组细胞总数扩增245.41倍,但c-kit+Lin-细胞扩增仅为15.80倍,明显低于C组(扩增c-kit+Lin-细胞为18.75倍)(P<0.05)。但D组细胞凋亡率最低,仅为4.66%。结论IL-3能协同SCF+HGF+FL+TPO+LIF有效的扩增c-kit+Lin-细胞,其表型并不受影响;但过高剂量反而促使干细胞分化。

汉黄芩素上调小鼠骨髓Lin-细胞Pecam1基因表达

[目的]探讨汉黄芩素对小鼠骨髓Lin-细胞增殖、分化、迁移、黏附关键功能基因表达的影响。[方法]采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓Lin-细胞,采用CD117作为标志进行细胞鉴定。应用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)芯片技术研究汉黄芩素对小鼠骨髓Lin-细胞功能基因表达的影响。采用黏附能力测定实验观察Lin-细胞的黏附能力。[结果]流式细胞技术结果显示,小鼠骨髓源性单个核细胞免疫磁珠分选后CD117的阳性率为93.7%;芯片结果发现汉黄芩素明显上调Lin-细胞血小板内皮细胞黏附分子-1(Pecam1)基因表达;黏附能力测定实验结果可见汉黄芩素增强Lin-细胞的黏附能力。[结论]免疫磁珠法分离小鼠骨髓Lin-细胞是一种较为理想的分离方法;汉黄芩素可能通过上调小鼠骨髓Lin-细胞Pecam1基因表达,从而增加Lin-细胞的黏附能力。

c-Kit^+Lin^-细胞移植改善急性肝损伤的实验研究

目的探讨骨髓c-Kit+Lin-(CD117)细胞移植治疗小鼠急性肝损伤的效果以及机制,为骨髓源性肝干细胞的临床应用提供实验依据。方法 18只成年BALB/c小鼠随机分为正常组、实验组和干细胞移植组,正常组不予任何处理,模型组小鼠腹腔注射CCl4后仅输入生理盐水,移植组小鼠在腹腔注射CCl4后尾静脉输注骨髓CD117细胞(1×106),48 h后观察各组小鼠肝功能水平变化,苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色分析肝脏病理学改变,免疫组化检测肝脏细胞增殖情况。结果模型组腹腔注射CCl4后肝功能严重受损,血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase,AST)、胆红素(bilirubin)等升高,肝脏的HE染色可见片状坏死,炎症细胞浸润;移植组小鼠移植干细胞48 h后小鼠肝功能有所恢复,病理提示肝脏坏死区域有所减小,Ki67免疫组化提示干细胞可促进肝脏再生。结论经尾静脉注入的骨髓来源的CD117干细胞能改善急性肝损伤肝功能以及修复受损肝脏,是治疗急性肝损伤的一种安全有效的方法。

大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞诱导分化为肝细胞过程中Klf4、Nanog基因的表达及启动子区甲基化观察

目的观察大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞诱导分化为肝细胞过程中Klf4、Nanog基因表达及启动子区CpG位点的甲基化变化。方法大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞在体外用25μg/L重组人肝细胞生长因子和0.1 nmol/L地塞米松诱导其分化,在诱导第0、7、14天分别提取细胞DNA和RNA。采用实时荧光定量PCR法检测Klf4、Nanog基因mRNA,甲基化特异性PCR法观察Klf4、Nanog基因启动子区CpG位点甲基化。结果与诱导第0天比较,第7、14天Klf4 mRNA相对表达量降低(P均<0.05);与诱导第0天比较,第7、14天Nanog mRNA相对表达量均降低(P均<0.05)。与诱导第0天比较,诱导第7天Klf4启动子区第1、2个CpG位点甲基化频率升高(P均<0.05);与诱导第7天比较,诱导第14天Klf4启动子区第1个CpG位点甲基化频率升高,第2、3个CpG位点甲基化频率降低,P均<0.05。与诱导第0天比较,诱导第7天Nanog启动子区第1个CpG位点甲基化频率降低,第2个CpG位点甲基化频率升高,P均<0.05;与诱导第7天比较,诱导第14天Nanog启动子区第1个CpG位点甲基化频率升高,第2个CpG位点甲基化频率降低,P均<0.05。结论大鼠CD90^+Lin^-骨髓细胞在体外诱导向肝细胞分化过程中,Klf4、Nanog基因表达随诱导时间增加呈现先下降后回升趋势,两者启动子区CpG位点甲基化程度随诱导时间增加出现不同程度变化;Klf4和Nanog基因启动子区CpG位点的甲基化变化不仅会影响Klf4、Nanog基因的表达,而且起到重要的调控作用。

促血小板生成素对骨髓c-Kit^+Lin^-细胞体外扩增的影响

目的探讨在无血清条件下,血小板生成素(TPO)对c-Kit+Lin-细胞增殖的影响。方法经免疫磁珠分离小鼠骨髓c-Kit+Lin-细胞,研究在干细胞因子(SCF)、FLt-3配基(FL)和白血病抑制因子(LIF)组合中添加不同浓度的TPO,7 d后检测细胞总数,c-Kit+Lin-细胞扩增倍数,并采用Annexin-V检测各组细胞凋亡率。结果各组均能显著扩增c-Kit+Lin-细胞,扩增倍数为4~7倍不等。当SCF+FL+LIF中加入50μg/L TPO时,c-Kit+Lin-细胞及细胞总数扩增为7.07倍和40.19倍,比未加时明显增多,而凋亡率无明显差异。但随剂量加大,c-Kit+Lin-细胞扩增下降,细胞凋亡率上升,200μg/L TPO组凋亡率为33.49%,c-Kit+Lin-细胞扩增倍数仅为4.11倍。结论TPO可协同SCF+FL+LIF使c-Kit+Lin-细胞增殖,但过高剂量会诱导其分化和凋亡,以50μg/L浓度扩增效果最佳。

miR-125a对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响及机制

目的探讨微小RNA-125a(miR-125a)对子宫内膜癌(EC)细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等生物学行为的影响及机制。方法常规培养人EC细胞(JEC、HEC-1B、Ishikawa细胞)和子宫内膜上皮细胞(ECS细胞)。用RT-PCR法检测细胞中miR-125a表达,筛选miR-125a表达最低的细胞为实验细胞。取对数生长期miR-125a表达最低的EC细胞,并将其随机分为miR-NC组、miR-125a mimics组,分别转染miRNA阴性对照miR-NC、miR-125a模拟物miR-125a mimics。用RT-PCR法检测miR-125a表达,用CCK-8实验检测细胞增殖活性(OD值),用平板克隆实验检测细胞集落形成能力,用流式细胞术检测细胞凋亡能力(凋亡率),用Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力,Western blotting法检测细胞内LIN28同系物B(LIN28B)蛋白表达。结果与ECS细胞比较,JEC、HEC-1B、Ishikawa细胞中miR-125a相对表达量均低(P均<0.05),且Ishikawa细胞miR-125a的相对表达量最低,将其作为实验细胞。与miR-NC组比较,miR-125a mimics组miR-125a表达高(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-125a mimics组培养24、48、72 h后OD值低,集落形成数少,凋亡率高,迁移细胞数、侵袭细胞数少,LIN28B蛋白相对表达量低,比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论上调miR-125a表达可抑制EC细胞增殖、迁移及侵袭,并诱导其凋亡,该作用可能与其靶向调控LIN28B表达有关。

miR-4500通过转录后下调LIN28B表达抑制乳腺癌细胞的迁移和增殖

目的观察微小RNA(miRNA,miR)-4500通过转录后下调LIN-28同系物B(lin-28 homolog B,LIN28B)基因表达对乳腺癌细胞HCC1937迁移和增殖的抑制作用。方法采用实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测乳腺癌细胞系(MB-MDA-468、MCF7、SKBR3、HCC1937)中miR-4500的表达。以miR-4500表达最低的乳腺癌细胞系(HCC1937)为对象,分别转染miR-4500模拟物和miR-NC,命名为miR-4500组和miR-NC组。real-time PCR检测转染效果。Transwell实验和噻唑蓝(MTT)实验检测转染后乳腺癌细胞迁移和增殖能力。生物信息学软件预测和双荧光素酶报告实验验证miR-4500的靶基因。real-time PCR和Western blot检测乳腺癌细胞中靶基因的表达。结果miR-4500在乳腺癌细胞系的表达显著低于正常乳腺上皮细胞(P<0.05),并在HCC1937细胞中表达最低(P<0.01)。miR-4500组miR-4500的表达(11.60±1.08)显著高于miR-NC组(1.22±0.48),差异有统计学意义(P<0.01)。与miR-NC组比较,miR-4500组细胞迁移和增殖能力均显著降低(P<0.05)。生物信息学软件显示miR-4500的靶基因是LIN28B。双荧光素酶报告实验证明miR-4500可靶向结合LIN28B基因(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-4500组HCC1937细胞中LIN28B的表达显著降低(P<0.05)。结论LIN28B基因是miR-4500的靶基因,miR-4500可通过转录后下调LIN28B基因表达抑制乳腺癌细胞HCC1937的迁移和增殖能力。

LIN-28B/Let-7/MYCN轴在神经母细胞瘤中的研究进展

神经母细胞瘤(NB)是儿童时期最常见的颅外实体肿瘤,高危患者临床进展迅速,治疗反应差,尤其晚期高危患儿对化疗及放疗不敏感,5年生存率非常低,严重影响儿童健康。MYCN癌基因、Let-7家族以及RNA结合蛋白(LIN-28B)在多种恶性肿瘤的发生发展中具有重要生物学功能,而且能够相互作用形成复杂的信号通路,在恶性肿瘤中所起的作用正日益受到重视。现有治疗对NB总体生存率的改善并不理想,MYCN癌基因、Let-7家族、LIN-28B以及LIN-28B/Let-7/MYCN轴可能在NB的发病机制中有重要作用,如果能够进一步明确NB的发病机制,或许能够为NB治疗提供新思路。

汉防已甲素对肝细胞生长增殖的影响

采用流式细胞技术观察不同浓度的汉防已甲素（Ｔｅｔ）对大鼠ＲＢＬ肝细胞生长增殖的影响。结果表明，随着Ｔｅｔ浓度的增加（１０～６０μｇ／ｍｌ），Ｇ２→Ｓ期的进程加速，且Ｓ期ＤＮＡ含量及Ｇ１和Ｇ２期蛋白质含量增加呈一定的量效关系。经加入外源性Ｃａ￣（２＋）及ＡＴＰ证实Ｔｅｔ促进肝细胞生长增殖的作用与阻断Ｃａ￣（２＋）内流无关。提示具有钙通道阻断作用的Ｔｅｔ可促进肝细胞生长增殖。

卵巢癌细胞株SKOV-3ipl缺氧与凋亡及其与细胞周期的关系

目的 :研究卵巢癌细胞株SKOV 3ipl细胞在缺氧条件下的凋亡与适应性及其与细胞周期的关系。 方法 :贴壁培养卵巢癌细胞株SKOV 3ipl在缺氧条件下培养 ,于 0小时、8小时、16小时、2 4小时分别收集细胞 ,应用FITCAnnexinV/PI双染色 ,PIDNA染色流式细胞检测细胞凋亡及细胞周期的改变。结果 :缺氧培养 0小时、8小时、16小时、2 4小时凋亡细胞百分率分别为 (0 32± 0 0 1) % ,(8 2 9± 0 87) % ,(4 2 3± 0 75 ) % ,(0 5 9± 0 0 8% )。8小时及 16小时缺氧与 0小时相比 ,凋亡增加 (P值 <0 0 1) ;2 4小时后凋亡与 0小时无差异 (P >0 0 5 )。各时相细胞周期的变化表现为 :G1期阻滞 ,S期缩短 (8小时及 16小时缺氧与 0时相比 ,P <0 0 1) ,缺氧 2 4小时后 ,各细胞周期与 0小时相比无差异。结论 :卵巢癌细胞株SKOV 3ipl在缺氧培养 8到 16小时内发生凋亡与细胞周期G1期阻滞 ,2 4小时后对缺氧耐受、细胞周期阻滞解除 ;SKOV 3ipl细胞对缺氧的耐受及抗凋亡与细胞周期阻滞无关。

他莫昔芬对人乳腺癌细胞(MCF-7)周期进程的影响

目的 :通过不同浓度的他莫昔芬 (TAM)对体外培养的MCF - 7细胞周期进程的影响 ,探讨TAM治疗乳腺癌的作用机制。以便为MCF - 7细胞同步化后 ,再应用化疗药物 ,为临床治疗乳腺癌奠定理论基础。方法 :采用人乳腺癌细胞MCF - 7体外培养 ,加入不同浓度的TAM(即 0 1nm ,10nm ,10 0nm和 1μm)培养一定时间后 ,检测其细胞周期各时相的变化。结果 :发现随TAM浓度的增高 ,MCF - 7细胞G0 /G1期不断增高。结论 :TAM可抑制MCF - 7细胞周期进程。TAM浓度在 1μm时 ,89 6 %的MCF - 7细胞集中在G0 /G1期。

三种TNF家族细胞因子对I型糖尿病相关胰岛β细胞株CM的作用

目的：研究三种TNF细胞因子家族成员TRAIL、FasL、LIGHT对糖尿病相关胰岛β细胞株CM的作用。方法：利用Annexin V-FTTC法及流式细胞仪技术分析CM对3种能引起Apoptosis的TNF家族成员RTAIL、FasL、LIGHT的敏感性。结果：CM对TRAIL极为敏感，用5ng/ml TRAIL与CM细胞孵育4h就能引起CM细胞产生明显的凋亡，而对FasL、LIGHT不敏感。结论：CM对RTAIL十分敏感，TRAIL有可能在I型糖尿病致病中起作用，是否起到关键作用，有待进一步研究。

糖尿病患者三种胰岛自身抗体的检测及其临床意义

目的观察1型、2型糖尿病患者(DM)外周血胰岛相关自身抗体的阳性率,并分析其可能的临床意义。方法应用ELISA法检测糖尿病患者血清中的谷氨酸脫羧酶抗体(GAD-Ab)、胰岛细胞抗体(ICA)、胰岛素自身抗体(IAA),并与正常人进行比较。结果1型DM组的ICA、IAA、GAD-Ab阳性率均显著高于2型DM组和正常人群组(P<0.01),一种及一种以上抗体阳性率高于单独一种抗体阳性率(P<0.05),2型糖尿病患者中小于30岁组的ICA、IAA、GAD-Ab阳性率明显高于小于50岁组(P<0.05)。结论三种胰岛自身抗体的联合检测有助于型糖尿病的诊断及鉴别诊断。

三带喙库蚊细胞系的建立及其特征研究

从三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)初孵幼虫组织建立了一个细胞系(CT-188),细胞生长于改良199培养基中。蚊卵的表面消毒方法简化为仅以70％酒精消毒10min。组织块接种后10～11d,可形成原代单层。传代细胞接种后,可在30min内贴壁,在48h达到分裂高峰,36～84h为细胞的对数生长期。细胞类型以梭形细胞为主(约占95％),掺杂少数圆形及不规则细胞。细胞核学特征以二倍体(2n=6)为主(约占80％以上)。目前,细胞已传至34代,均冷冻保存于液氮(-196℃)中,且复苏成功。经鉴定本细胞系无病毒及支原体污染。

CDC50A在宫颈癌原代细胞中的表达及对干细胞特性的影响

目的:探讨人宫颈癌原代细胞的分离、培养、鉴定方法以及细胞周期蛋白50A(CDC50A)对其生物学特性的维持作用。方法:收集2017年1月~2018年2月期间在妇科进行宫颈手术的24例宫颈癌患者和10例行子宫全切术患者的宫颈组织标本;采用蛋白酶消化法分离宫颈癌组织,通过原代培养、流式细胞术分选法将宫颈癌原代细胞分为CDC50A^(+)Lin^(-)细胞组,CDC50A-Lin^(-)细胞组,采用MTT法测定各表型细胞体外增殖活性以及体内成瘤能力;采用端粒重复扩增法(TRAP)结合电泳及银染法测定端粒酶活性。结果:①宫颈癌原代细胞表型CDC50A^(+)Lin^(-)的细胞仅占0.95%~5.64%;且宫颈癌组织中CDC50A阳性表达率为87.5%,明显高于正常宫颈黏膜组织,差异有统计学意义(P<0.05);②CDC50A^(+)Lin^(-)细胞体外增殖活性以及集落形成能力明显高于CDC50A-Lin^(-)细胞和未分选细胞,差异有统计学意义(P<0.05);③裸鼠皮下接种CDC50A^(+)Lin^(-)细胞,2周就可观察到明显的新生肿瘤块,成瘤率明显高于接种CDC50A-Lin^(-)细胞和未分选细胞,差异有统计学意义(P<0.05);④CDC50A^(+)Lin^(-)细胞端粒酶相对表达强度为显著高于对照组细胞和CDC50A-Lin^(-)细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CDC50A有可能是分选人宫颈癌干细胞的表面标志物,CDC50A^(+)Lin^(-)细胞具有肿瘤干细胞的生物学特性。

增塑盐改性准固态电解质染料敏化纳米晶太阳能电池

实验使用一种增塑性试剂—双（三氟甲基磺酰）亚胺锂改性PEO-PVDF基聚合物电解质设计并制备了一系列不同浓度双（三氟甲基磺酰）亚胺锂[LiN（SO2CF3）2,LiTFSI]改性的PEO基聚合物电解质。在聚合物电解质中LiTFSI起着增塑剂的作用,经其改性后,聚合物电解质的玻璃化转变温度降低,有利于高分子链段运动和离子传输,进而提高离子的电导率。最终对经增塑盐改性的电解质的特性及其所组装的染料敏化纳米晶太阳电池的光电转换性能进行了研究。

林丽珠辨治肾癌经验探析

林丽珠教授认为肾癌的病机不外乎肾亏、湿热、痰瘀、毒瘀,强调不同分期辨证原则不一,需将宏观辨证和微观辨病相结合,早期应扶助正气,清热利湿;中期祛瘀化痰,解毒散结;晚期补益肝肾,培元固本。林教授并指出在辨证的过程中,应分清主症兼症、标本缓急,正确处理整体与局部的关系,并强调抑瘤中药在其中的应用,扶正祛邪,使机体达到平和的状态。附肾癌医案一则加以说明。