抗白垩病相关SNP位点C2587245T在意大利蜜蜂雄蜂幼虫中的抗性鉴定

【目的】基于抗白垩病相关单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点C2587245T在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica雄蜂幼虫中白垩病抗性检验,验证该位点遗传稳定性和抗病性,为分子标记辅助育种在育种生产中直接应用提供技术支持。【方法】通过白垩病虫尸,在实验室条件下制备白垩真菌孢子悬液,通过形态学和分子生物学方法鉴定蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis。使用无伤害方法提取意大利蜜蜂蜂蜂王DNA筛选出SNP位点C2587245T为C/C和T/T基因型的蜂王,并培育C/C和T/T基因型处女王,用二氧化碳刺激其产出雄蜂卵,选择C和T基因型2日龄意大利蜜雄蜂幼虫进行实验室培养,3日龄龄雄蜂幼虫接种5×10^(4)个孢子/μL的蜜蜂球囊菌悬液10 d,观测接种蜜蜂球囊菌后的C基因型和T基因型雄蜂幼虫的生长情况和存活率。【结果】通过无伤害提取DNA的方法可以在不影响意大利蜜蜂雄蜂幼虫正常生活的条件下提取出高质量的DNA;用本研究的饲养方法可以保证意大利蜜蜂雄蜂幼虫在实验室条件的正常生长发育。C基因型和T基因型意大利蜜蜂雄蜂3日龄幼虫接种蜜蜂球囊菌后在发病时间和发病症状等方面都有明显差异,C基因型雄蜂幼虫在表现疾病典型症状的时间上比T基因型雄蜂幼虫晚大约2 d;在接种蜜蜂球囊菌后6 d时两种基因型雄蜂幼虫表现出的症状差异最为明显。【结论】雄蜂由于其纯合单倍体的生物学特性,更方便验证SNP位点C2587245T纯合的抗病作用。SNP位点C2587245T为C基因型雄蜂幼虫具有良好的抗白垩病能力,并且SNP位点C2587245T具有稳定的遗传性,这些研究结果可为在蜜蜂抗病育种领域提供一种可靠的分子辅助标记,为后续雄蜂转录组测序、寻找雄蜂和工蜂在免疫相关基因表达方面的差异,尝试找到SNP位点C2587245T对白垩病所特有的抗病机制提供基础。

蜜蜂白垩病防治方法综述

白垩病是蜜蜂中常见的高传染性、高致病性的真菌病,其致病性可能会导致患病蜂群覆灭,给蜜蜂养殖业造成巨大损失。文章综述了白垩病的诱发因素、发病规律、表征及防治方法等,以期为我国蜜蜂白垩病的防治提供一定的理论参考。

蜜蜂白垩病的研究进展

蜜蜂白垩病(bee chalkbrood disease)是由蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis引起的真菌性传染病,主要感染蜜蜂幼虫。白垩病是养蜂业中主要潜在病害之一,影响着世界养蜂业的发展。本文就目前国内外对蜜蜂球囊菌的研究,分别从该病的发生、分布范围、分类学、流行病学、发病机理、蜜蜂的免疫防御反应、综合防治等方面进行综述,希望为今后开展相关研究工作提供理论依据。

蜜蜂患白垩病虫体内一株球囊菌拮抗细菌的分离与鉴定

【目的】寻找抑制蜜蜂球囊菌的拮抗菌,用于白垩病的生物防治。【方法】利用细菌纯化技术从患白垩病的蜜蜂幼虫体内分离纯化了一株对蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)有抑制作用的细菌,并结合形态学、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析技术进行鉴定,同时通过蜜蜂体内、体外接种试验研究其对蜜蜂球囊菌的抑制作用。【结果】该细菌被初步鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),它在培养基中能够完全抑制蜜蜂球囊菌的生长,但其发酵液对蜜蜂球囊菌的生长没有影响。将含菌饲料喂蜜蜂幼虫,蜜蜂幼虫的死亡率和生长发育没有受到影响,说明该细菌对蜜蜂幼虫没有致病性。蜜蜂幼虫体内同时接种细菌和球囊菌孢子,发现细菌对球囊菌在蜜蜂体内的萌发和初期菌丝的生长没有影响,蜜蜂依然能够患病,但生长后期该细菌能够降解球囊菌菌丝,对球囊菌子代孢子的产生表现出一定的抑制作用。【结论】该研究结果为蜜蜂白垩病的生物防治提供了理论依据。

蜜蜂球囊菌荧光PCR快速检测方法的建立及应用

以蜜蜂球囊菌ITS1、ITS2和5.8 S rDNA保守序列(U68313)为参考,设计一对特异性引物和一条TaqMan探针,建立了一种快速检测蜜蜂球囊菌的荧光PCR方法。该方法灵敏度达1 ng/μL的阳性DNA比常规PCR高10倍。检测的特异性高,与蜜蜂幼虫芽胞杆菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂败血杆菌无交叉反应,同时可避免常规PCR因电泳造成的污染。应用该方法对蜜蜂及蜂制品的实际样品和模拟样品进行检测,结果显示所建立的荧光PCR检测方法在4 h内即可报告结果,与传统病原菌分离培养、常规PCR相比较,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点,可以用于蜜蜂及其制品中蜜蜂球囊菌的快速检测和进出境检疫。

不同辐照剂量对蜂球囊菌杀灭效果的影响

本试验以蜂球囊菌(Ascosphaera apis)为研究对象,探究不同辐照剂量对蜂球囊菌的杀灭效果,以期明确有效杀灭蜂球囊菌的最低辐照剂量,为Co60γ射线辐照蜜蜂饲料(特别是蜂花粉)时的辐照剂量选择提供依据。利用细菌纯化技术从患白垩病意蜂幼虫体内分离纯化得到蜂球囊菌,并结合形态学、乳酸酚棉兰染色及5.8SrDNA序列分析技术进行鉴定;同时制备不同梯度浓度的蜂球囊菌孢子悬液加入到蜜蜂幼虫饲料中,以饲喂方式侵染3日龄意蜂幼虫,确定半数致死浓度(LC50);蜜蜂幼虫饲料中添加上述确定LC50的孢子,以不同辐照剂量处理,并通过侵染幼虫试验,确定有效杀灭蜜蜂饲料中孢子的最低辐照剂量。结果表明,通过形态学和分子生物学鉴定,从患白垩病的意蜂幼虫体内分离纯化得到真菌即为蜜蜂白垩病的病原——蜂球囊菌;蜂球囊菌对人工饲养条件下的意蜂幼虫的LC50为9.5×104个/mL;当Co60γ射线辐照剂量为7.0kGy时,幼虫患病率与未辐照组差异显著(P<0.05),由此确定对添加半数致死浓度的蜂球囊菌孢子饲料的最低有效辐照剂量为7.0kGy。

蜜蜂白垩病病原观察及其综合防治措施

从患白垩病的蜜蜂幼虫尸体上分离出了病原菌——蜜蜂球囊菌.经马铃薯酵母浸出汁培养基培养,观察到蜜蜂球囊菌的生长过程及其形态.并对蜜蜂白垩病提出了综合防治的措施.

意大利蜜蜂染色体DNA非编码区抗白垩病相关的SNP的筛选与验证

【目的】筛选验证意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica染色体DNA非编码区与抗白垩病相关的SNP。【方法】本研究将蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis孢子接种于人工饲养的意大利蜜蜂3日龄幼虫,根据是否存在白垩病症状进而筛选出抗病个体和易感个体。基于前期重测序结果中意大利蜜蜂第2和11号染色体DNA非编区与抗白垩病相关的SNP信息,利用PCR测序的方法筛选并验证意大利蜜蜂幼虫第2和11号染色体DNA非编码区与幼虫抗白垩病相关的55个SNP。【结果】发现位于意大利蜜蜂第11号染色体LOC100578413基因5′端的非编码区的SNP(T14570310C)在抗病个体中T等位基因频率高于C等位基因频率,且抗病个体中的T等位基因频率显著高于易感幼虫中的T等位基因频率,表明该SNP位点与抗白垩病相关。该分子标记对抗性个体和易感个体的判断结果与前期筛选的编码区SNP(C2587245T)分子标记的结果一致。【结论】筛选并验证意大利蜜蜂第11号染色体DNA非编码区的SNP(T14570310C)与抗白垩病相关。该位点为抗白垩病分子辅助选育提供新的分子标记,在意大利蜜蜂白垩病早期检测和培育白垩病抗性的蜂种方面具有重要意义。

蜜蜂白垩病的病原和防治技术研究

蜜蜂白垩病是西方蜜蜂( Apis mellifera L.) 的一种新的恶性传染病。从白垩病的蜜蜂幼虫尸体分离出病原菌蜂球囊菌( Ascosphaera apis) ,经光学显微镜观察,该菌的菌丝直径2 .0 ～3 .0 μm ,孢囊为黑色球状,直径40 .0 ～45 .0 μm ;孢囊内有许多孢子球,孢子球的直径9 .0 ～11 .0 μm ;孢子球又由许多孢子组成;孢子表面光滑,呈肾形或长椭圆形,大小2 .4 μm ×1 .2 μm ,孢子长与宽的比值为2 .0 。通过感染试验,确定了蜜蜂白垩病的病态发展过程以及蜜蜂幼虫的最易感染日龄。总结出影响该病的因素以及该病消长规律,提出了以防为主,防治结合的综合防制措施。

大蒜素对蜜蜂球囊菌的抑菌和杀菌活性研究

本研究旨在探明大蒜素对蜜蜂白垩病的病原菌蜜蜂球囊菌在体外的抑菌和杀菌活性。试验以蜜蜂球囊菌为受试菌,采用琼脂倍比稀释法测定最小抑菌浓度(MIC),采用琼脂培养基法测定最小杀菌浓度(MBC),测试大蒜素对蜜蜂球囊菌的体外抑菌和杀菌活性。结果表明,大蒜素对蜜蜂球囊菌的MIC为12.0mg/mL,MBC为24.0mg/mL。证实大蒜素在体外对蜜蜂球囊菌具有较好的抑菌和杀菌作用。

蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性与菌株毒力关系的研究

为了探讨蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)胞外蛋白酶活性(PU)与其毒力的关系,评价胞外蛋白酶活力作为毒力指标的可靠性。本研究测定了9个不同来源地的蜜蜂球囊菌菌株的胞外蛋白酶活性及接种后各日累积蜜蜂幼虫死亡率和致死中时(LT50),将胞外蛋白酶活性与接种后各日累积死亡率及致死中时(LT50)进行回归分析,以确定胞外蛋白酶活性与其对蜜蜂幼虫的毒力间的相关性。结果表明各菌株胞外蛋白酶活性与其毒力间的存在显著相关性。因此,蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性可作为大量菌株筛选的参考毒力指标,但不能作为测定相关性的唯一指标。

中、意蜂抗白垩病能力的检测与分析

蜜蜂白垩病(chalkbrood disease)是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis)引起的蜜蜂幼虫死亡的真菌性疾病,该病已蔓延至世界各地并对养蜂业造成严重危害。本研究采用20个患白垩病蜜蜂黑色干尸混合50 g花粉粉碎,用蜂蜜混和制成条状花粉饼对意蜂蜂群进行人工接种感染,发现意蜂蜂群在接种前后患病个数差异显著(P=0.0227);自然情况下发病率差异显著不同组的蜂群之间在接种感染前后患病个数差异均显著(P=0.0238和P=0.0211),证实了不同蜂群抗白垩病能力确实存在显著差异。采用封盖子脾冷冻法检测了5群意蜂蜂群的清理能力,发现蜂群内幼虫的患病个数与清理率呈显著负相关(P=0.01 87),说明蜂群清理能力越强患白垩病的个数越少。采用蜂群白垩病人工接种方法对3个中蜂蜂群进行接种感染,结果均没有发现中蜂幼虫患白垩病。采用封盖子脾冷冻法检测蜂群的清理能力,发现中蜂和意蜂蜂群的清理能力无显著差异(P=0.2638),提示中蜂蜂群的抗白垩病能力可能由其他因素决定。

蜜蜂白垩病的研究进展与防治

蜜蜂白垩病(bee chalkbrood disease)是Priss在1911首次发现的,是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)寄生而引起蜜蜂幼虫死亡的真菌性传染病。1981年在第28届国际养蜂大会上,正式命名为白垩病。该病1992年在我国爆发,逐渐影响了全国范围内的意大利蜂,成为影响我国蜂业发展的主要病害之一,近年该病虽然得到一定控制,但危害时有发生。就白垩病的病理与防治的研究概况进行介绍,以期引起大家对该病的重视。

意大利蜜蜂不同蜂群抗白垩病能力差异的研究

白垩病是意大利蜜蜂(Api s melli f era li gust i ca,简称意蜂)的一种常见真菌性疾病,不同蜂群间的抗白垩病能力强弱差异检测是抗病育种的基础。研究通过实验比较分析意蜂不同蜂群抗白垩病能力的差异。采用DPS软件方差分析系统分组实验统计分析和Tukey法多重比较,对4群患病蜂群和4群健康蜂群自然状态和接种蜜蜂球囊菌病原状态下的3次检测结果分别进行统计分析。结果表明:自然情况下不同蜂群间的抗病能力有差异;1号蜂群在接种蜜蜂球囊菌前、后蜂群患病个体数均显著高于其他蜂群(p<0.05);用白垩病死尸粉末拌入花粉饲喂的方法可以有效诱发蜂群发生白垩病;实验筛选出抗白垩病能力强、弱的蜂群为抗白垩病相关分子标记提供素材。

蜜蜂白垩病防治药物的筛选及蜂群抗病机理的探讨

本研究先后采用２０多种药物，经过对蜜蜂球囊菌进行实验室抑菌试验和生产上防治试验，从中筛选与组配出了对蜜蜂白垩病防治效果好、对蜂群使用安全的“复方抗白垩”药物．并对蜂群的抗病机理进行了探讨．

分子技术在蜜蜂白垩病病原鉴定和诊断上的应用

蜜蜂白垩病是一种由球囊菌属(Ascosphaera)的真菌寄生而引起蜜蜂幼虫死亡的传染性疾病,对蜂群的群势发展影响极大,近几年又呈现出大面积爆发的趋势。但目前对于该病的诊断和病原鉴定多依赖于典型症状,方法极不可靠。本文介绍了可用于分子鉴定和诊断的的研究基础,探讨利用球囊菌属的各病原rDNA的ITS1-5.8S-ITS2序列资料,分别设计出高特异性引物,用PCR技术扩增出可用于鉴定病原物种的分子标记,从而构建一套快速、准确诊断该病的分子技术。

基于蜜蜂球囊菌纳米孔测序数据的基因非翻译区延长、SSR位点发掘及未注释基因和转录本鉴定

【目的】利用已获得的纳米孔长读段测序数据完善现有的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis参考基因组注释信息,并对未注释的新基因和新转录本进行鉴定和功能注释。【方法】基于已获得的纳米孔长读段测序数据,采用gffcompare软件将蜜蜂球囊菌全长转录本与参考基因组注释的转录本进行比较,进而对参考基因组注释基因的非翻译区(untranslated region,UTR)进行延长。利用TransDecoder软件对蜜蜂球囊菌基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)及相应的氨基酸序列进行预测。通过MISA软件发掘长度在500 bp以上的全长转录本的SSR位点。通过Blast工具将鉴定到的新基因和新转录本比对Nr,KOG,eggNOG,Swiss-Prot,Pfam,GO和KEGG数据库进行功能注释。【结果】共对蜜蜂球囊菌的9481个基因进行了UTR延长,其中5′UTR和3′UTR延长的基因分别有4744和4737个。共预测出10492个完整ORF,其中编码长度分布在0~100和100~200个氨基酸的ORF最多,分别占ORF总数的38.96%和36.90%。共鉴定到5286个SSR,其中单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复和六核苷酸重复的SSR分别为1870,826,2398,138,43和11个。共鉴定到1558个新基因,其中有1556,731,330,592,1177,709和589个新基因可分别被注释到Nr,Swiss-Prot,Pfam,KOG,eggNOG,GO和KEGG数据库。此外,还鉴定到14403条新转录本,其中有14376,8524,7276,7405,12035,7891和6855条新转录本可分别被注释到上述7个数据库。【结论】本研究利用已获得的纳米孔长读段测序数据对蜜蜂球囊菌的完整ORF进行了预测,对参考基因组的已注释基因进行了UTR延长,对未注释的SSR位点进行了发掘,此外还鉴定到大量未注释的新基因和新转录本,并对它们进行了功能注释。研究结果较好地完善了现有的蜜蜂球囊菌的基因组注释,为其组学和分子生物学研究的深入开展提供了基础。

蜜蜂白垩病病原的分离与鉴定

为了解伊犁河谷蜜蜂白垩病的流行情况及研究快速诊断方法,本试验开展了该病的流行病学调查,并将50份疑似样品处理后采用分离培养法、镜检法及PCR法对病原菌进行了分离与鉴定。结果5份为阳性,阳性率10%,培养基菌落颜色呈白色,较致密,中央凸起,老化菌落颜色呈浅棕色至棕色;镜检可见树枝状分枝的有隔菌丝,二叉分枝间距较大,菌丝体呈疏松的蛛网状,用乳酸棉监染色液染色后菌丝为蓝色;PCR反应结果为阳性,阳性结果测序后所得序列用Blast软件比对,与球囊菌属的蜜蜂球囊菌基因序列相似性最高,达到99%。上述结果表明,从伊犁河谷病蜂中分离的病原菌为蜜蜂白垩病病原。

水溶性壳聚糖对蜜蜂球囊菌抑制效果的研究

蜜蜂白垩病是由蜜蜂球囊菌引起的幼虫死亡的真菌性传染病。幼虫食用变质的蜂花粉后可以引发此病。壳聚糖及其衍生物对一些常见的细菌、霉菌、酵母菌等具有抑菌作用却无任何毒性。应用生长速率法和二倍试管稀释法研究水溶性壳聚糖对蜜蜂球囊菌的抑制作用,并比较水溶性壳聚糖和两性霉素B对球囊菌的最小抑菌浓度和抑制效果。水溶性壳聚糖对蜜蜂球囊菌具有一定的抑制效果。当溶液浓度在0.01～0.10g/mL范围内时,抑菌率随着浓度增加而增大;当浓度达到0.05g/mL时,抑菌率在50%以上;当浓度趋于0.07g/mL时,抑菌率增加趋于缓慢,之后趋于稳定。浓度为0.09g/mL时,壳聚糖溶液比两性霉素B的抑制效果更好。虽然水溶性壳聚糖的最小抑菌浓度比两性霉素B要高,但从环保的、经济学的和耐药性方面来看,壳聚糖更具有优势。

HRM法在意大利蜜蜂抗白垩病相关SNP位点C2587245T检测中的应用

蜜蜂全基因组存在丰富的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分子标记,SNP分子标记的基因分型有多种方法,其操作难度、费用及所需时间都有差异,建立合适、易行、廉价的分型方法在分子辅助育种的实际应用中具有重要意义。本研究利用高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)法对意大利蜜蜂幼虫抗白垩病相关单核苷酸多态性位点C2587245T进行检测,结果表明HRM法能够有效的对该位点进行基因分型,为意大利蜜蜂抗白垩病分子辅助选育提供较方便的检测方法,具有重要的理论价值和应用前景。