DSB修复基因hKu70反义RNA真核表达载体构建

目的 构建人DNA双链断裂 (DSB)修复基因hKu70反义RNA真核表达载体pEGFP C1 K ,为以后的hKu70基因功能和毒理学研究提供实验材料。方法 提取人胚肺成纤维细胞 (HLF)总RNA ,逆转录酶 多聚酶链式反应 (RT PCR)扩增hKu70基因cDNA保守序列 ,经与pGEM T载体连接、筛选、克隆、抽提质粒和双酶切后 ,将纯化的hKu70基因cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP C1中 ,筛选、克隆、抽提质粒 ,从而构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP C1 K。结果 经RT PCR获得 467bp含限制性内切酶位点的DNA片段 ,T载体克隆后经双酶切、测序 ,确定该片段为hKu70基因cDNA ,进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP C1 K ,并双酶切 ,测序确证。结论 成功构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP C1 K ,为建立该基因低表达细胞株。

双链断裂修复蛋白hKu70缺陷细胞株的建立及其生物学特性

目的 建立并鉴定DNA双链断裂 (DSB)修复蛋白hKu70缺陷细胞株 ,并观察该缺陷细胞的某些生物学效应 ,用于hKu70基因功能及职业有害因素对DNA双链断裂修复影响的研究。方法 用构建的hKu70基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体 (pEGFP C1 K)转染人胚肺成纤维细胞 (HLF) ,用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hKu70基因的表达水平。同时观察转染细胞生长形态 ,绘制生长曲线 ,软琼脂培养法鉴定恶性程度。结果 pEGFP C1 K载体在转染细胞内可较稳定表达 ,hKu70蛋白缺陷细胞株hKu70基因的蛋白表达水平下降了 42 % ,转染后hKu70蛋白缺陷细胞生长形态、生长速度无明显变化 ,软琼脂培养未见细胞集落。结论 成功建立和鉴定了hKu70蛋白缺陷细胞株 。