基于液相色谱-串联质谱技术鉴定药物靶标的研究进展

药物靶标是指细胞、组织或器官的特殊结构,它能与药物相互作用,促使药物发挥疗效。全面识别药物靶标对了解药物的作用机制及其潜在的副作用至关重要。目前,应用广泛的药物靶标识别和鉴定技术,如基于活性的蛋白质分析(activity-based protein profiling,ABPP)、以化合物为中心的化学蛋白质组学(compound-centric chemical proteomics,CCCP),需要对化合物小分子进行修饰,这可能会降低甚至改变药物分子的活性。因此,无需对药物分子进行化学修饰的技术,如药物亲和反应的靶标稳定(drug affinity responsive target stability,DARTS)、细胞热位移分析(cellular thermal shift assay,CETSA)和热蛋白质组分析(thermal proteome profiling,TPP),逐渐成为药物靶标研究的重要手段。液相色谱-串联质谱技术是鉴定药物靶标蛋白的重要工具。本文综述了基于液相色谱-串联质谱技术的药物靶标研究方法的应用,并对药物靶标鉴定技术的未来发展进行了展望。

重组人成骨生长肽的表达、纯化和活性的研究

将人工合成的人成骨生长肽基因 (hOGPgene) ,与质粒pTYB2 重组 ,转化大肠杆菌E .coliBL2 1 (DE3) .经异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,融合蛋白在E .coli中得到表达 .菌体经超声破碎 ,一步亲和层析纯化得到重组人成骨生长肽 (recombinanthumanosteogenicgrowthpeptide ,rhOGP) .体外实验证明 :rhOGP对成纤维细胞 (NIH3T3)的增殖有促进作用 .体内实验证明 :rhOGP加速兔移植骨成活 ,使血清中碱性磷酸酶活性增高 ,骨钙素增高 .重组人成骨生长肽促进成骨 。

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及抗栓活性研究

目的摸索蚯蚓纤溶酶的分离纯化工艺和研究蚯蚓纤溶酶的抗血栓活性。方法采用分步盐析、透析、凝胶色谱和亲和色谱法分离纯化蚯蚓纤溶酶 ;此酶的体内抗栓活性检测采用动静脉旁路血栓形成抑制实验法。结果分离纯化得到的蚯蚓纤溶酶比活高 ,为 16 0 5IU/mg ;蚯蚓纤溶酶的体内血栓形成抑制效果比尿激酶作用显著。 结论该法分离纯化工艺简单 ,特异性好 ,纯化的纤溶酶比活高 ;

间接竞争ELISA检测大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白

采用酸沉淀、亲和层析(ConA-Sepharose 4B)等手段,成功地分离纯化了大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白,SDS-PAGE检测表明2种蛋白纯度分别达到95%和90%。将纯化的11S球蛋白和7S伴球蛋白分别免疫大白兔获得抗血清,并建立起间接竞争ELISA检测大豆豆粕及其深加工产品中11S和7S抗原蛋白含量的方法。

短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的分离纯化及活性测定

目的从短尾蝮蛇毒中分离纯化纤溶酶原激活剂(plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom,GBV-PA),对其理化性质及部分生物活性进行研究。方法应用苯甲脒-琼脂糖凝胶(Benzamidine Sepharose6B)亲和层析及Lichrospher C18反相层析柱进行分离纯化,应用SDS-PAGE测定分子量、聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳测定等电点,以发色底物法测定生物活性。结果通过亲和层析、反相层析等方法可从短尾蝮蛇毒中分离纯化出纤溶酶原激活剂至电泳纯以上,其相对分子质量约为32.6×103,等电点约为5.2,能特异激活人纤溶酶原为纤溶酶,其比活性为2.87t-PA IU.mg-1;该酶为丝氨酸蛋白酶,对纤维蛋白无亲和性。结论应用亲和层析和反相层析可从短尾蝮蛇毒获得一种纤溶酶原激活剂;该酶为丝氨酸蛋白酶,对纤维蛋白无亲和性。

人细胞核dUTPase的克隆表达及其酶学活性

以阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)患者脑cDNA文库质粒为模板 ,用PCR方法扩增得到人细胞核dUTP焦磷酸酶 (dUTPase)的cDNA ,将其克隆到谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX 4T 1中 ,并在大肠杆菌BL2 1中获得高效表达 .表达的融合蛋白GST dUTPase经过谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,凝血酶酶切和SephacrylS 10 0纯化 ,得到高纯度dUTPase蛋白 .通过SDS PAGE ,氨基酸组成分析 ,N端氨基酸序列测定以及HPLC测Mr 结果与期望值一致 .通过检测该酶水解dUTP释放的焦磷酸 (PPi)来测定表达产物dUTPase蛋白及GST dUTPase融合蛋白的酶活性 ,发现两蛋白都具有正常的酶水解dUTP活性 ,但融合蛋白的活性比dUTPase蛋白低 7～ 8倍 .同时研究了Mg2

嗜水气单胞菌气溶素的纯化及其溶血特性分析

目的用亲和纯化法纯化嗜水气单胞菌气溶素,从单因子水平分析嗜水气单胞菌的溶血特性。方法用嗜水气单胞菌气溶素单克隆抗体McAb3C12B11为配体制备亲和层析柱,甘氨酸洗脱以获得纯化的嗜水气单胞菌ZN1气溶素。获得的纯化气溶素分别与1%欧洲鳗鲡血红细胞、1%兔血红细胞、1%羊血红细胞进行溶血特性分析,并利用单克隆抗体McAb3C12B11进行溶血抑制试验。结果经亲和纯化获得分子量约为51.7kDa的气溶素,该气溶素能在Western-blotting反应中被嗜水气单胞菌ZN1胞外产物(ECPs)免疫血清和McAb3C12B11所识别。溶血试验证实亲和纯化的ZN1气溶素和ZN1ECPs对兔血红细胞、欧洲鳗血红细胞和绵羊血红细胞的溶血效价分别为5.12×104HU/mg、3.20×103HU/mg、6.40×103HU/mg和2.56×104HU/mg、1.28×104HU/mg、3.20×103HU/mg。溶血抑制试验结果表明:当红细胞为1%兔血红细胞时,McAb3C12B11对气溶素和ZN1ECPs的溶血抑制效价均为1∶211;当红血细胞为1%欧洲鳗血红细胞时,McAb3C12B11对气溶素的溶血抑制效价为1∶210,对ZN1ECPs的溶血抑制效价仅为1∶23。结论嗜水气单胞菌气溶素在单因子条件下与嗜水气单胞菌ECPs的溶血特性存在一定的差异,嗜水气单胞菌ZN1ECPs中存在多种溶血性毒素,这些毒素对不同宿主的溶血能力存在差异,同一嗜水气单胞菌菌株对不同的宿主起主要作用的溶血性毒素不同。

肿瘤抑素相关肽T42肽的纯化及抗肝癌细胞Hepg2活性的测定

目的:利用已成功构建的肿瘤抑素相关活性肽T42肽高效表达基因工程重组菌pTYB2-T42,提取纯化T42肽,检测其抗肿瘤活性,为研究T42肽抗肿瘤作用机制及新型抗肿瘤药物研发提供实验基础。方法:将pTYB2-T42大肠杆菌进行培养,IPTG诱导其产生融合蛋白,经几丁质柱亲和层析得到目的蛋白,葡聚糖凝胶G15去除DTT干扰,TricineSDS-PAGE鉴定T42肽,紫外分光光度法检测其浓度。MTT检测T42肽对细胞的生长增殖抑制作用,AO/EB荧光染色检测细胞凋亡形态学变化。结果:提取的T42肽其相对分子质量在5000左右,与理论值4600一致。MTT实验结果显示:T42肽作用下Hepg2细胞生长增殖受到抑制,且随着T42肽浓度的增加,Hepg2细胞存活率逐渐下降,其半数抑制浓度(IC50)为30mmol.L-1;AO/EB荧光染色结果表明:经过30mmol.L-1T42肽作用24h后的Hepg2细胞表现出细胞皱缩呈圆形或卵圆形,核皱缩变形且胞膜受损等一系列细胞凋亡特征性的形态变化。结论:T42肽具有显著的抗肿瘤细胞活性,可明显抑制人肝癌细胞Hepg2的生长增殖,并促进其凋亡。

无水体系中环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶制备高载量固定化金属亲和层析介质

在以二甲基亚砜为溶剂的无水体系中,利用环氧氯丙烷对琼脂糖凝胶Sepharose6FastFlow进行活化,并偶联亚氨基二乙酸和Cu2+制备了固定化金属亲和层析介质.结果表明,该体系中环氧氯丙烷对琼脂糖凝胶的活化效率大幅度提高,在40%(φ)环氧氯丙烷、0.02g/mLNaOH及50℃、反应时间4h的优化条件下,环氧基活化密度最高达165μmol/mL,较目前报道的最高值提高50%以上.最终所制介质的Cu2+螯合密度为128.3μmol/mL,对BSA的平衡吸附容量达2.05mmol/L.以0.5mol/L咪唑为洗脱剂,被吸附的BSA洗脱率可达90%以上.

血红素亲和层析快速纯化香椿子抗氧化活性蛋白

以蛋白质含量、总还原力和DPPH清除能力为指标,对盐析法、碱提酸沉法、直接加热法进行评价,选取蛋白含量高同时有较强还原力的碱提酸沉提取法。将环氧氯丙烷活化血红素偶联于Sephadex G-25制作亲和层析柱,以水为平衡液、Na Ac-HAc缓冲液为洗脱液进行香椿子蛋白纯化,考马斯亮蓝法测定所得蛋白纯度,并对其进行初步抗氧化研究。结果表明:目标产物蛋白具有较好的DPPH清除能力,含量由59.51%提高至96.23%,纯化后蛋白纯度得到显著提高(P<0.05)。

CTLA-4/Ig融合蛋白在COS-7中的表达、纯化及鉴定

目的 探讨pCTLA 4/Ig融合蛋白表达载体在哺乳动物细胞中的表达及表达产物的鉴定、纯化 ,为其功能研究和临床应用奠定基础。方法 将pCTLA 4/Ig表达质粒转染COS 7细胞 ,双抗体夹心ELISA检测细胞培养上清中融合蛋白表达 ;ProteinA亲和层析纯化 ,SDS PAGE、Western印迹、3H TdR掺入等进行分子量、纯度、抗原特异性及生物学活性鉴定。结果 在pCTLA 4/Ig质粒转染后的 48h和 96h上清中 ,均能检测到CTLA 4/Ig融合蛋白表达 ;经亲和层析纯化后 ,在SDS PAGE胶上出现一条分子量约 5 0× 10 3 的与预期分子量大小相符的蛋白条带 ,该蛋白能与抗人CTLA 4单抗特异结合 ;该纯化融合蛋白能抑制人MLR ,抑制率为6 0 %～ 70 %。结论 在哺乳动物细胞中成功地表达并纯化了有生物学活性的重组人CTLA 4/Ig融合蛋白。

以人参皂苷Rg1为配基的亲和色谱介质的制备与初步应用

通过偶联人参皂苷Rg1(Rg1)与环氧活化琼脂糖凝胶6B(epoxy-activated SepharoseTM6B,EAS6B),制备以Rg1为配基的亲和介质,以红外色谱法验证其偶联,并采用正交设计方法优化偶联条件为40℃,pH13,每毫升EAS6B添加Rg1100μmol;以此条件放大工艺制备的亲和介质偶联率为31.47%,偶联量为31.56μmol/mL;利用Rg1-EAS6B亲和介质,以系列亲和色谱法,从PC12细胞蛋白裂解液中筛选得到1个Rg1特异性结合蛋白的条带,为制备含有类似活性基团的中药有效成分的亲和色谱介质提供参考依据,也为进一步探讨人参皂苷Rg1的作用机制奠定基础。

枯草芽孢杆菌CS16菌株抑菌活性物质的提取分析

枯草芽孢杆菌CS16发酵液经盐酸沉淀,甲醇抽提得到粗提物,稳定性试验结果表明,抑菌物质在pH2～11较稳定,对温度、紫外、有机溶剂耐受力较好。利用中压液相色谱得到较纯的抑菌物质,薄层层析后显色分析表明,该抑菌物质初步可以确定为酚类物质。

组织纤溶酶原激活物的分离纯化

用亲和层析法从猪心组织分离纯化纤溶酶原激活物(tissue type plasminogen activator,t-PA),以纤维蛋白-sepharose-4B 和 lys-sepharose-4B 两种亲和胶,从5 kg 新鲜猪心组织中分离出 t-PA1.46mg,比活性为235000 IU/mg,得率为34%,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定为一条带,分子量为68000。

膜亲和色谱的现状、发展和应用

文章对膜亲和色谱的原理、特点、设备、过程和发展情况做了介绍，并对亲和膜在整个膜分离技术中的地位、所占的比重及市场预测做了述评，对膜亲和色谱与其它色谱分离技术的优缺点进行了比较。重点介绍了制备亲和膜的材料，活化方法，问隔臂和配基的种类、选择和共价键合方法，配基和配合物产生亲和作用的机理及解离过程和方法。并对膜亲和色谱在酶、蛋白质、核糖核酸等生物大分子纯化分离方面的应用情况做了述评。

苦马豆素提取工艺及检测方法研究进展

苦马豆素是疯草类植物的主要毒性成分,是危害草原畜牧业和草原生态健康发展的重要因素之一。而近年来最新研究发现,苦马豆素又是一种天然抗免疫抑制药物,被认为是最有前景的肿瘤候选药物之一,显示出其广阔的应用潜力。结合近年来现代检测技术在苦马豆素研究领域的最新研究成果,综述了苦马豆素的提取工艺、检测方法的最新研究成果,并重点从薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、α-甘露糖苷酶活性抑制分析法(α-MIA)等几个方面介绍了苦马豆素定性、定量检测方法,并对各种检测方法的优缺点进行了比较。

分泌型肿瘤坏死因子相关激活诱导因子融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

目的 表达及纯化人分泌型肿瘤坏死因子相关激活诱导因子 (secretedformTNF relatedactivation in ducedcytokine,sTRANCE)蛋白。方法 将sTRANCE结构基因重组到含麦芽糖结合蛋白 (MBP)的融合蛋白原核表达载体 pMAL c2x中 ,在大肠杆菌中进行表达。 结果 经IPTG诱导表达出的MBP sTRANCE融合蛋白相对分子质量约 70 0 0 0 ,并经Westernblot分析证实。用直链淀粉琼脂糖凝胶 (amyloseresin)亲和层析纯化得到电泳均一的融合蛋白。结论 成功地获得sTRANCE蛋白 ,为进一步研究其生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性打下了基础。

从Cohn法组份Ⅳ中分离纯化人血浆蛋白C

目的探索建立1种串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化蛋白C的方法 ,降低纯化蛋白C的成本,并实现血浆的综合利用。方法 4℃条件下,将Cohn法组份Ⅳ用PBS缓冲液抽提5h,离心(6500g)40min,上清液依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤后,超滤透析;再通过串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析,对蛋白C进行纯化。通过SDS-PAGE鉴定蛋白C的纯度;用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;通过WHO指定的发色底物法和凝固法(一期法)测定蛋白C活性。结果纯化的蛋白C在SDS-PAGE图谱上呈现1条62kD左右的蛋白带;经过离子交换层析,蛋白C的活性回收率为(48.19±9.22)%,纯化倍数为(3.75±0.56)倍;固相化金属螯合亲和层析后,蛋白C活性回收率为(59.61±5.59)%,纯化倍数为(36.79±3.72)倍;蛋白C总活性回收率为(28.77±9.45)%,纯化倍数为(136.64±6.82)倍,比活性为(11.70±0.89)IU/mg。结论串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析可以从Cohn法组份Ⅳ中获得比活性较高的蛋白C浓缩物。

半夏凝集素的分离纯化和在植物中的分布

从半夏(Pinellia ternata)块根中,经95％硫酸铵沉淀和固定化猪甲状腺球蛋白柱亲和层析分离得到一种凝集素,称为半夏凝集素(PTL)。凝胶过滤、SDS-PAGE和免疫双扩散鉴定PTL是均一的样品,分子量约44kD,由四个约12kD的亚基组成。PTL主要存在于半夏的块茎中,茎中也有少量存在。

抗人肿瘤坏死因子-α单链抗体与其配体的相互作用

为了在大肠杆菌中表达纯化抗人 TNF- α单链抗体并检测其结合活性与中和活性 .利用GST融合蛋白系统在大肠杆菌中表达抗人 TNF- α单链抗体 E6Sc Fv;分离包含体后进行变性和复性 ,再用亲和层析法进行纯化 ;用 ELISA法和酵母双杂交系统检测 E6Sc Fv与配体的结合 ;用 L92 9细胞检测 E6Sc Fv对人 TNF- α细胞毒作用的中和活性 .经变性 ,复性与亲和层析 ,E6Sc Fv被纯化 ,在 SDS- PAGE上为单一蛋白带 ;体外结合与中和实验表明 ,表达纯化的 E6Sc Fv可与人 TNF-α结合并中和其细胞毒活性 ;进一步用酵母双杂交系统证明当表达于细胞内时 ,E6Sc Fv仍保持了与TNF-α相结合的能力 .