鸡γ-干扰素基因的克隆及其在原核和真核系统中的表达

应用一步法逆转录—聚合酶链式反应 (RT_PCR)技术对罗曼蛋鸡γ_干扰素基因 (CHIFN_γ)进行了扩增。试验结果表明 ,在植物血凝素 (PHA) 5 0 0 μg/mL、细胞浓度 2 .5× 1 0 6/mL、诱导 1 0h,能从外周血淋巴细胞和脾淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段。将RT_PCR产物克隆到PGEM_Teasy载体 ,经过限制性酶切分析、测序证实克隆到的CHIFN_γ基因正确 ,命名为PGEM_CHIFN_γ。序列分析表明 ,CHIFN_γ基因与已发表的鸡IFN_γ基因的同源性为 95 .6%～ 1 0 0 % ,氨基酸水平同源性为 92 .8%～ 1 0 0 % ,与鸭IFN_γ核苷酸同源性为 67.5 %。将CHIFN_γ基因克隆到原核表达载体pGEX_6P_1的GST基因的下游 ,经IPTG诱导后表达出了 43kD的融合蛋白 ,超声波裂解后发现融合蛋白主要以包涵体的形式存在 ,裂解上清无抑制病毒活性 ;然而将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3 .1中 ,通过脂质体转染COS_1细胞 ,用鼠抗CHIFN_γ高免血清进行间接免疫荧光试验 (IFA) ,结果表明在COS_1细胞的细胞膜和胞浆内均有CHIFN_γ表达 ,且细胞病变抑制试验证实 ,转染后细胞培养上清有干扰素活性 ,在鸡胚成纤维细胞 (CEF)上抑制VSV病毒的效价可达到 1 0 2 4U/ml。这些结果表明真核表达系统对CHIFN_γ基因表达产物的活性有重要影响。