鼠疫菌pH6抗原的提取、纯化与鉴定

使用ＫＣＮＳ解离、硫酸铵沉淀、电泳制备分离并纯化了鼠疫菌ｐＨ６抗原。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图型显示，提取物为单一蛋白，参照标准，推算其分子最约１５ｋＤ。多数情况下，在其上方尚有一条含最较低、表征分子量约１６ｋＤ的蛋白带，用Ｆ１单克隆抗体及１５ｋＤ蛋白制备的抗血清分别进行测定，该蛋白仅能与１５ｋＤ蛋白的抗血清产生高滴度反应，从而排除了其为Ｆ１抗原的可能性。依据上述实验结果并结合ＬｉｎｄｌｅｒＬＫ等的资料分析，该蛋白与提纯抗原属同一物质，表征分子量间的差异，很可能是分子量较大的一种（约１６ｋＤ）带有一段１ＫＤ的信号序列所致。用精制的ｐＨ６抗原免疫小鼠４只，所有小鼠于初次免疫后的第３０天放血测定，均与提纯抗原出现了高滴度的阳性反应，说明尽管提纯蛋白的方法不够温和，有可能使蛋白发生变性，但其免疫原性基本不受影响，做一般使用时可不做复性处理。

鼠疫菌pH6抗原的免疫效果观察

对实验条件下鼠疫耶尔森氏菌 p H6抗原的免疫效果及其对鼠疫强毒菌再攻击的保护力进行了观察 :(1)建立了鼠疫菌 p H6抗原的酶联免疫吸附试验 (简称 p H6 Ag- EL ISA)及间接红细胞凝集试验 (简称 p H6 Ag- IHA)检测技术 ,检测敏感、特异 ;(2 )用常规方法免疫小鼠 ,以 p H6 Ag- EL ISA和 p H6 Ag- IHA两种方法进行检测 ,实验动物均出现了较高滴度的免疫反应 ,其最高滴度分别为 1∶ 12 80 0和 1∶ 10 2 40 ;(3)对 40只免疫昆明小鼠进行鼠疫强毒菌攻击 ,其半数致死量虽较对照组稍有提高 ,但保护效果不明显 ;对产生这一结果的原因进行了分析 ,在此基础上 。

鼠疫菌pH6抗原单克隆抗体的研制及鉴定

:(1)依据 p H6抗原的生化特征及表达条件 ,对不同温度 (37℃和 2 8℃ )及不同酸碱度 (p H6和 p H7)条件下培养细菌的提取物进行了电泳图型对比 ;(2 )依照上述电泳图型 ,并结合该抗原的分子量 ,确定了 p H6抗原的电泳迁移位置 ;(3)采用 KCNS洗脱、(NH4) 2 SO4盐析、制备电泳的方法提取和纯化了鼠疫耶尔森氏菌 (Yersinia pestis) p H6抗原 ,SDS-PAGE分析表明 ,提取物均一 ,表征分子量符合 ,回收率较高 ;(4)使用纯化抗原免疫普通小鼠 5只、BAL B/ c小鼠 3只 ,免疫效果良好 ,利用获得的免疫血清 ,建立了 p H6抗原多克隆抗体的 EL ISA检测技术 ,应用于融合细胞中阳性克隆的筛检及实验动物的免疫效果评价 ,应用结果证实 ,检测敏感、有效 ;(5 )利用细胞融合技术获得杂交瘤 17株 ,对其中的 4株进行了 3次再克隆并经半年反复冷冻、复苏及上清检测 ,证实瘤株分泌抗体稳定 ;(6 )对所获单抗进行了 Western blotting(蛋白印迹试验 )鉴定 ,结果显示抗体特异。

鼠疫菌pH6抗原的电泳图型识别及其体外表达条件

ｐＨ６抗原是鼠疫菌毒力的重要组成部分，研究结果显示，这种抗原很可能与腺鼠疫的发病机制有关。为提供国内急需的ｐＨ６抗原纯品，研究和观察了该抗原的体外适宜表达条件。结果表明，在四种常规培基中，ｐＨ６抗原均可表达，但在ＬＢ培基中，该抗原的表达量明显高于其他培基。此外，还进行了两种ｐＨ及两种温度条件下该抗原表达量的比较，如预期的那样，该抗原仅在酸性和３７℃条件下最大限度表达。根据该抗原不同时ＰＨ和温度条件下十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—ｐＡＧＥ）图型的比较、参照已单体分子量，初步识别了该抗原的电泳图型，为今后进一步提取、纯化这种抗原成分奠定了基础。

鼠疫耶尔森氏菌caf1和pH6基因的原核表达

目的利用DNA重组技术,在大肠杆菌中获得融合表达的鼠疫耶尔森氏菌caf1及p H6抗原基因。方法利用分子克隆技术克隆后,在原核系统中表达鼠疫菌重要功能蛋白caf1及p H6蛋白,根据云南玉龙菌株(D106004)全基因组序列设计引物,PCR扩增目的基因片段;采用p ET-32a(+)作为表达载体,通过双酶切和连接反应,将目的基因片段定向插入载体中,构建重组表达质粒;IPTG诱导,使重组质粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中表达。结果根据酶切鉴定和PCR产物测序结果显示,目的基因caf1及p H6已成功连接到表达载体p ET-32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物的相对分子质量约为34.2 ku和35.5 ku,与理论分子量一致。结论成功克隆并构建了p ET32a-caf1及p ET32a-p H6重组基因原核表达系统,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定了基础。