NAPP体外抗乙型肝炎病毒作用的实验研究

[目的]应用HepG2.2.15细胞株作为体外抗乙型肝炎病毒的实验模型,研究NAPP对乙肝病毒的抑制作用。[方法]以NAPP梯度浓度与HepG2.2.15细胞混合培养,通过MTT法检测药物的细胞毒性,9 d后取细胞培养上清液,用ELISA法测定HBsAg、HBeAg含量,荧光定量PCR检测上清液中病毒载量。[结果]NAPP浓度在1 mg/ml时,对细胞无明显毒性;NAPP在所稀释的各浓度下,对HBsAg、HBeAg均有抑制作用,对HBsAg、HBeAg的治疗指数分别大于188.7和64.5;NAPP可抑制HBV-DNA的复制。[结论]NAPP体外对HBV有显著的抑制作用。

原卟啉钠的制备方法改进

以氯高铁血红素为原料 ,经脱铁、酯化一步得原卟啉二甲酯粗品。该粗品经甲苯处理纯化后 ,用氢氧化钠皂化得 98%以上纯度的原卟啉钠。总收率 91.5 %。

原卟啉钠体内外抗乙肝病毒作用研究

目的观察原卟啉钠体内外抗乙肝病毒作用。方法体内实验采用先天感染鸭乙肝模型,检测给药前、给药后5 d、10天及停药后3 d鸭血清DHBV-DNA的动态变化;体外实验采用2.2.15细胞为模型,检测用药后对细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的抑制作用。结果体内实验显示,给药第5,10 d时鸭血清DHBV-DNA其OD值均明显低于给药前,差异有显著性意义(P<0.05);体外实验显示,原卟啉钠在所稀释的各浓度下,对细胞分泌HBsAg,HBeAg均有一定的抑制作用,对HBsAg,HBeAg的治疗指数分别大于188.7和64.5。结论原卟啉钠体内外均具有明显的抗乙肝病毒作用。

利用动物血液制备原卟啉钠的研究进展

我国动物血液资源丰富,利用动物血液提取血红素,经原卟啉二甲酯等中间制备过程,可制得原卟啉钠(NAPP)。有机溶剂法、柱色谱、层析法和高效液相色谱法等是目前用于分离纯化卟啉类化合物的主要方法。NAPP是一种水溶性钠盐,具有降酶保肝作用,现作为一种肝功能改善制剂用于临床肝功能受损病人的肝功能恢复。近年来,有学者还对其抗肝炎病毒活性及机制进行了初步研究,发现NAPP在体内外具有抗乙型及丙型肝炎病毒作用。可见,利用动物血液制备NAPP对于充分利用我国丰富的动物血液资源及促进动物生化药物的研究开发具有重要意义。论文就NAPP的制备、分离纯化方法、用途及活性作用等方面进行了概述。

药物作用量-效关系的Thiele型连分式插值法分析

目的:提出Thiele型连分式插值法,研究并建立新的量-效关系分析方法。方法:以原卟啉钠(NAPP)抑制人肝癌细胞株SMMC-7721细胞增殖的实验数据为例,基于Thiele型连分式插值,求出量-效关系表达式并绘制量-效曲线图;预测最大抑制率,计算半抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)和半效浓度(half effective concentration,EC50);求导并绘制导数图,研究抑制率随药物浓度变化的快慢程度。结果:通过Thiele型连分式插值法,得出NAPP作用于SMMC-7721细胞24、48、72 h的量-效关系表达式,预测不同时间下最大抑制率分别为43.75%,55.97%,64.93%;EC50分别为1.04 mg/L、0.36 mg/L、0.30 mg/L;作用48 h、72 h后IC50分别为16.46 mg/L、8.26 mg/L。导数图表明NAPP浓度在10 mg/L内,抑制率随浓度变化速度快,药效不稳定;大于10 mg/L后,变化不明显,药效稳定,出现平台期。结论:Thiele型连分式插值法简单、实用,逼近效果好,可作为研究药物量-效关系的一种新方法。

利用血红素制备原卟啉钠的工艺优化研究

目的:建立并优化利用血红素制备原卟啉钠的工艺。方法:采用单因素试验方法,从甲醇用量、1mol/L氢氧化钠甲醇溶液用量、加热回流温度和加热回流时间4个主要因素对NAPP的制备工艺进行优化。结果:原卟啉钠的平均产量为3.46 g/5 g血红素,纯度为88.8%;确定的最佳提取工艺参数是:甲醇用量70 ml,1 mol/L氢氧化钠甲醇溶液用量80 ml,加热回流温度90℃,加热回流时间2 h。结论:建立的原卟啉钠制备工艺操作简便,周期短,成本低,产量较高,是一种较理想的制备原卟啉钠方法。

原卟啉二钠体外对丙型肝炎病毒复制子的抑制作用

目的:探讨原卟啉二钠(PPN)体外对丙型肝炎病毒(HCV)的抑制作用。方法:用不同浓度PPN和利巴韦林处理HCV复制子细胞模型,MTT法检测药物的细胞毒性作用;荧光定量PCR检测HCV RNA。结果:PPN和利巴韦林浓度在1 mg·mL-1以下时,MTT法比色A值比较,实验组与对照组间差异均无显著性,无明显细胞毒性;PPN在1 mg·mL-1时对HCV RNA的抑制率为73.44%,差异有显著性(P<0.05),利巴韦林在1 mg·mL-1时对HCV RNA的抑制率为40.78%,差异无显著性,二者抑制HCV RNA的EC50分别为0.23 mg·mL-1和1.19 mg·mL-1。结论:PPN和利巴韦林浓度在1 mg·mL-1以下时对HCV Replicon细胞生长无毒性作用;PPN具有明显的体外抑制在HCV复制的作用,抑制作用强于利巴韦林。

非抗凝动物血提取原卟啉二钠的实验研究

探讨非抗凝动物血提取原卟啉二钠的方法。将凝固动物血中的蛋白质水解,分离出血红素,制备原卟啉甲酯、原卟啉等中间产物,最终精制获得原卟啉二钠;并根据原卟啉二钠的光吸收特性,利用分光光度法对其进行定量检测。原卟啉二钠为红褐色结晶,可溶于水,不溶于氯仿、乙醚及丙酮,易溶于酸性溶液。溶于酸性溶液后,在波长600nm、556nm、及408nm显示吸收峰,最大吸收波长为408nm。利用本方法可将非抗凝动物血精制成原卟啉二钠,且该方法是目前以非抗凝动物血为原料提取原卟啉二钠较为理想的方法。

原卟啉二钠的抗鸭乙型肝炎病毒作用

目的:研究原卟啉二钠(PPN)抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用。方法:采用先天感染DHBV的龙岩麻鸭为动物模型,分设模型对照组、拉米呋啶组和PPN组,各组按20 mg.kg-1.d-1灌胃给药10 d,斑点杂交法观察用药前、用药5 d、10 d及停药后3 d血清中DHBV DNA表达,HE染色观察肝脏组织病理学变化。结果:PPN组于用药后5 d1、0 d,血清DHBV DNA水平分别为1.36±0.261、.05±0.28,与模型对照组2.04±0.05、1.90±0.31比较明显降低(T5P<0.05、T10P<0.01),病理检查发现PPN组肝细胞点状坏死明显减轻,与模型对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。结论:PPN有抑制DHBV DNA的作用,并具有明显的抗炎、保肝作用。

非抗凝动物血制备原卟啉二钠的方法改进

目的利用非抗凝猪血简易制备原卟啉二钠。方法提取非抗凝猪血中的血红素、经氯化血红素、原卟啉二甲酯、原卟啉等中间制备过程,最后制取原卟啉二钠。结果所制得的原卟啉二钠为紫黑色晶体,可溶于水和甲醇,不溶于氯仿、乙醚、丙酮,难溶于稀酸,纯度为91.4%。结论此方法可利用非抗凝动物血中的血红素制备原卟啉二钠。该方法制备条件要求不高,操作简便、原料易得、成本低廉,是一种较为理想的制备原卟啉二钠的方法。

PPN抑制HBV-DNA表达及复制的体外实验

目的 体外观察PPN对HBV DNA表达、复制的抑制效果及其细胞毒性作用。方法 取 10 μg/ml、2 0 μg/ml、 4 0 μg/ml、 80 μg/ml、 16 0 μg/mlPPN水溶液分别加入 2 2 15细胞株培养悬液中 ,8天后用放射免疫法检测上清液中HBeAg的含量 ,并计算HBeAg抑制率、细胞存活率、HBeAg抑制率为 5 0 %时的药物浓度 (ID50 )、实验组存活细胞为对照组的 5 0 %时的药物浓度 (CD50 )和治疗指数 (TI)。PCR技术检测HBV DNA阳性血清中加入 16 0 μg/mlPPN水溶液后对HBV DNA复制的抑制作用。 结果 当加入的PPN浓度为 16 0 μg/ml和 80 μg/ml时 ,HBeAg抑制率分别为 89 8%和 82 4 % ,细胞存活率分别为 98 7%和 99 2 % ;HBV DNA阳性血清中加入PPN后可有效抑制其复制。结论 PPN可有效抑制HBV DNA的表达和复制 ,且对靶细胞 (肝细胞 )无细胞毒作用 。

原卟啉二钠对氯丙嗪致肝功能异常的预防作用

目的:原卟啉二钠片预防抗精神病药致肝功能异常的疗效。方法:将精神分裂症患者随机分为预防组(第1组、第2组和第3组)和空白组(第4组),预防组分别在不同时间给予原卟啉二钠片,而空白对照组未服用任何保肝药,观察临床症状及ALT、AST的变化。结果:预防组的肝功能指标与空白对照组比较有统计学意义(P<0.001)。结论:原卟啉二钠片具有明显的预防抗精神病药致肝功能异常的疗效。

超声结合原卟啉Ⅸ对腹水型S180肿瘤细胞的损伤作用

目的:根据原卟啉IX(PpIX)在S180肿瘤细胞内的含量变化及亚细胞定位分析,研究聚焦超声结合PpIX对S180肿瘤细胞的损伤作用。方法:应用荧光分光光度法测定PpIX在S180肿瘤细胞内的富集;激光共聚焦扫描显微镜观察PpIX的亚细胞定位;台盼蓝拒染法检测超声结合不同浓度的PpIX作用后细胞的存活率;环境扫描电镜观察细胞膜表面超微结构变化。结果:PpIX在S180肿瘤细胞内的富集是一个动态变化过程,45min达到最高点,此时为最佳声照处理时间点,且此时PpIX主要定位于细胞膜;超声激活PpIX对S180肿瘤细胞的杀伤作用明显大于单纯超声组,其膜损伤程度也更为严重。结论:细胞膜可能是超声激活PpIX作用的一个主要靶点。

原卟啉钠对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制

目的:研究原卟啉钠(NAPP)对四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制。方法:60只ICR小鼠随机分为正常对照组、模型组、联苯双酯组、NAPP低、中、高剂量组,每组10只。各治疗组每天ig给予联苯双酯(0.2 g.kg-1)或不同剂量(0.03,0.06,0.12 g.kg-1)的NAPP,连续10 d后,1次性ip CCl4 0.06 g.kg-1建立急性肝损伤模型。16 h后,摘眼球取血测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性;剖腹取肝,称质量,计算肝脏指数;制备肝组织匀浆测定过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量,并观察肝组织病理学变化。结果:与CCl4模型组比较,各治疗组小鼠肝脏指数、血清ALT和AST活性不同程度降低(P<0.05,P<0.01);肝组织匀浆中CAT,GSH-Px,SOD活力不同程度升高(P<0.05,P<0.01),MDA含量不同程度降低(P<0.05,P<0.01);病理切片表明NAPP各治疗组小鼠肝损伤不同程度减轻,其中高剂量组肝损伤程度最轻。结论:NAPP对CCl4所致小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用,其机制可能与NAPP的抗脂质过氧化作用和阻止抗氧化酶活性降低有关。

原卟啉钠体外对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的抑制作用

目的:研究原卟啉钠(NAPP)体外对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的抑制作用。方法:通过对人正常肝细胞株QSG-7701细胞的药物毒性实验筛选出NAPP对人正常肝细胞无明显毒性的最大无毒浓度(TC0)。以TC0为起始浓度,10倍梯度稀释成5个不同的NAPP浓度,作用于体外培养的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,通过MTT比色法测定NAPP对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用;经倒置光学显微镜和Hoechst33258染色倒置荧光显微镜进行形态学观察,计数凋亡细胞,并计算凋亡指数(AI);采用AnnexinⅤ-FITC/PI双标流式凋亡检测试剂盒经流式细胞仪检测SMMC-7721细胞凋亡和坏死率。结果:不同浓度NAPP作用后,SMMC-7721细胞的增殖明显受到抑制,A值明显降低(P<0.05或P<0.01),且抑制率呈一定的浓度-时间依赖性;光学显微镜下见细胞个数明显减少,细胞密度明显变稀,细胞形态发生了明显变化,很多细胞间的连接消失,细胞变圆、皱缩或见细胞外形变长呈长梭形;荧光显微镜下细胞呈典型的凋亡形态学改变,AI显著升高(P<0.05或P<0.01);经流式细胞仪检测,可见SMMC-7721细胞凋亡和坏死率不同程度升高。结论:NAPP在体外对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞具有一定的抑制增殖、促进凋亡和坏死的作用。

糖肝康对硫代乙酰胺所致慢性肝损伤模型大鼠肝脏组织结构和Resistin表达的影响

目的:研究糖肝康对糖尿病慢性肝损伤模型大鼠肝脏组织结构及Resistin表达的影响。方法:链脲佐菌素联合硫代乙酰胺腹腔注射建立糖尿病慢性肝损伤大鼠模型,并分为5组(n=10):模型动物+生理盐水组,模型动物+护肝宁组,模型动物+糖肝康小剂量组、中剂量、大剂量组,另加正常动物+生理盐水组,正常动物+糖肝康组,分别灌胃。药物干预12周后,分别采用光镜及Western Blotting方法观察检测糖肝康对肝脏病理结构及Resistin表达的影响。结果:造模后大鼠的肝脏组织结构改变,且肝脏组织中Resistin表达升高;而糖肝康用药组大鼠不仅肝脏组织病理结构有明显改善,而且Resistin异常表达也受到明显抑制。结论:糖肝康可改善肝脏组织的病理改变,还可通过抑制Resistin表达水平,起到对肝脏的保护作用。

原卟啉钠对急性肝损伤小鼠肝脏氧化酶影响

目的探讨原卟啉钠对四氯化碳(CCI4)致急性肝损伤小鼠肝组织过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力影响。方法 60只ICR小鼠随机分为正常对照、模型组、联苯双酯、原卟啉钠低、中、高剂量组;原卟啉钠组每天灌胃给药;造模16 h后,剖腹取肝进行病理组织学检查,计算肝脏指数,测定肝组织匀浆液CAT和GSH-Px活力。结果模型组小鼠肝组织CAT和GSH-Px活力分别为(19.67±4.46),(193.39±42.36)U/(mg.prot),与正常对照组比较明显降低(P<0.01);联苯双酯组、原卟啉钠低、中、高剂量组CAT和GSH-Px活力分别为(29.98±4.79),(27.74±6.11),(28.13±5.67),(33.82±6.00)U/(mg.prot)和(265.72±48.42),(200.24±39.30),(231.73±46.70),(257.64±37.11)U/(mg.prot),明显高于模型组(P<0.05);病理切片显示,原卟啉钠各剂量组小鼠肝损伤有不同程度减轻。结论原卟啉钠具有一定抗氧化作用,能有效阻止CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织CAT和GSH-Px活性降低。

从非抗凝猪血中制备原卟啉钠方法的建立及优化研究

目的:建立并优化从非抗凝猪血中制备原卟啉钠的方法。方法:先以非抗凝猪血制得血红素,再加入硫化亚铁等经酯化、皂化反应制得原卟啉钠;采用紫外吸收光谱与红外光谱对其进行定性检测、紫外分光光度法对其进行定量检测;通过正交试验对原卟啉钠的制备方法进行优化,确定最佳工艺参数。结果:建立了从非抗凝猪血中制备原卟啉钠的方法,每千克非抗凝猪血可以制得10.6g血红素,每5g血红素可以制得3.46g原卟啉钠,所得原卟啉钠经紫外和红外光谱鉴定证实,纯度为88.8%;最佳制备工艺是酯化时甲醇-氯仿加入量为70mL∶120mL、皂化时甲苯-1mo·lL-1氢氧化钠甲醇溶液用量为50mL∶80mL、90℃加热回流2.0h。结论:所建立的制备原卟啉钠的方法操作简便,原料易得,周期短,成本低,产量较高,是一种较理想的制备原卟啉钠的方法。