uPAR通过MAPK信号抑制细胞自噬促进胰腺癌增殖、侵袭及化疗抵抗的作用研究

背景与目的:尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR)基因扩增与胰腺癌患者的不良预后密切相关。uPAR通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号转导通路调控胰腺癌细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)和化疗抵抗,但具体机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨uPAR通过抑制细胞自噬促进胰腺癌细胞增殖、侵袭和化疗抵抗的机制。方法:收集2021年12月—2022年6月在南华大学附属长沙中心医院(长沙市中心医院)接受手术切除和穿刺活检患者的胰腺癌组织标本[获得长沙市中心医院医院伦理委员会批准,编号:2021-S0182,2022-S0084],体外培养胰腺癌患者来源类器官(patient-derived organoids,PDO);使用6种胰腺癌细胞系(AsPC-1、PANC-1、CAPAN-1、CAPAN-2、MIA PaCa-2和PaTu8988T),利用成簇规律间隔短回文重复序列及其关联核酸酶9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9,CRISPR/Cas9)技术构建uPAR缺陷模型。采用共聚焦显微镜、蛋白质印迹法(Western blot)、酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和MTS实验测定细胞增殖、侵袭能力,并分析MAPK和自噬信号通路以及吉西他滨诱导的细胞死亡变化。采用RNA干扰(siRNA)或自噬抑制剂评估联合治疗的协同作用。结果:在AsPC-1细胞中,uPAR敲除后,MTS实验和损伤修复实验结果显示,与野生型细胞相比,克隆细胞的增殖和迁移能力显著降低,对吉西他滨的敏感性降低。uPAR重新表达后,克隆细胞的增殖和侵袭能力恢复,且对吉西他滨的敏感性部分恢复。共聚焦显微镜结果显示,克隆细胞的F-肌动蛋白减少,细胞变得圆滑。Western blot结果显示,与野生型细胞相比,克隆细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)和Slug表达升高,波形蛋白(vimentin)表达降低;磷酸化-黏着斑激酶(phospho-focal adhesion kinase,p-FAK)、p-p38MAPK和微管相关蛋白1的轻链3B(microtubule-associated protein light chain 3B,LC3B)表达升高(P<0.05)。siRNA结果表明,沉默FAK或p38MAPK或联合自噬抑制均能使克隆细胞对吉西他滨重新敏感,沉默p38MAPK能降低LC3B表达。类器官研究显示,8例类器官对吉西他滨的响应存在差异,uPAR在8例胰腺癌类器官中均有表达,uPAR表达水平与吉西他滨的半数抑制浓度(half-maximal inhibitory concentration,IC50)呈负相关(r2=0.66,P<0.05),3例类器官对吉西他滨联合自噬抑制剂响应良好(P<0.05)。结论:uPAR通过抑制胰腺癌中依赖p38MAPK信号通路的细胞活性,防止FAK介导的耐药性和细胞休眠。本研究提示,uPAR高表达的胰腺癌患者对吉西他滨反应更好,而uPAR低表达且p38MAPK高表达的肿瘤可能从联合使用自噬抑制剂和细胞毒性化疗药物治疗中受益。

DADS负调控uPAR/uPA信号抑制人结肠癌SW480细胞侵袭和EMT

目的探讨二烯丙基二硫(DADS)抑制人结肠癌SW480细胞侵袭和上皮间质转化(EMT)的可能机制。方法免疫组化检测结肠癌组织中尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)受体(uPAR)的表达。基因转染技术构建uPAR过表达细胞。实验分为SW480组、SW480+DADS组、uPAR组、uPAR+DADS组。迁移、侵袭实检测各组细胞迁移与侵袭能力。RT-PCR、Western blotting分别检测相关信号通路分子mRAN及其蛋白的表达。裸鼠实验验证DADS对uPAR过表达SW480细胞移植瘤的影响。结果结肠癌组织中uPAR表达显著高于癌旁正常黏膜组织(P<0.05)。成功构建稳定uPAR过表达SW480细胞。uPAR过表达上调uPA、uPAR表达,而DADS下调uPA、uPAR表达。uPAR过表达增强细胞迁移、侵袭能力,DADS抑制uPAR过表达细胞的迁移、侵袭能力。DADS通过下调Vimentin、基质金属蛋白酶(MMP-9)表达,上调E-cadherin、组织金属蛋白酶抑制物(TIMP)-3表达抑制SW480细胞EMT。裸鼠实验结果显示,DADS可体内抑制uPAR过表达SW480细胞EMT。结论DADS通过负调控uPAR/uPA信号体内外抑制人结肠癌SW480细胞侵袭和EMT。

胃癌组织中uPA和uPAR mRNA表达及临床意义

目的 :探讨uPA和uPARmRNA表达水平与胃癌细胞恶性程度、浸润转移的关系及其临床意义。方法 :运用cDNA mRNA斑点杂交技术定量、平行地检测了 2 3例胃癌及相应癌旁组织中uPA和uPARmRNA表达水平 ,并综合分析了uPA和uPARmRNA表达水平与胃癌临床生物学指征的相关意义。结果 :uPA和uPARmRNA表达水平在 2 3例胃癌组织中 ,分别有 18例uPA和 19例uPAR高于相应癌旁组织 ;14例uPA和uPAR协同高于癌旁组织 4倍以上 ;在伴有淋巴结转移和浸润到肌层、浆膜层的胃癌组织中均明显增高 ;Ⅲ、Ⅳ期胃癌组织也明显高于Ⅰ、Ⅱ期胃癌组织。结论 :在基因转录水平 ,胃癌组织中uPA和uPAR表达呈增高趋势 ;具有浸润转移的胃癌组织表达增强 ;uPA和uPAR基因的高表达是影响胃癌细胞恶性程度和浸润转移的重要因素之一。

uPAR表达对鼻咽癌侵袭和转移的影响

目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活剂受体 (uPAR)对鼻咽癌侵袭和转移的影响。方法 以鼻咽癌细胞系 (CNE 2Z)及其克隆株 (CNE 2Z H 5 ,CNE 2Z H 5 9)作为研究材料 ,应用逆转录聚合酶反应 (RT PCR )检测uPAR在基因转录的表达 ;应用蛋白免疫印迹 (Westen Blotting)方法检测uPAR蛋白水平的表达 ;通过异质黏附抑制实验 ,观察uPAR在鼻咽癌细胞侵袭和转移过程中的作用。结果 uPAR在CNE 2Z H 5 9中表达最高 ,其次为CNE 2Z H 5 ,在CNE 2Z中表达最低 ;uPAR抗体能抑制CNE 2Z H 5 9的异质黏附能力。

Anti-uPAR单克隆抗体顺铂对胶质瘤增殖和uPAR蛋白表达的影响

目的研究Anti-uPAR单克隆抗体、顺铂对人脑胶质瘤细胞U251皮下瘤增殖影响以及尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)在U251皮下瘤的表达特征,评估其在胶质瘤恶性生长方式中的作用。方法以人脑胶质瘤细胞株U251为材料,制作裸鼠皮下胶质瘤模型。应用Anti-uPAR单克隆抗体、抗肿瘤药物顺铂干预肿瘤生长进程,使用免疫组化技术观察uPAR在肿瘤细胞的表达以及抗肿瘤效果。结果Anti-uPAR单克隆抗体、抗肿瘤药物都成功地抑制了肿瘤的生长,顺铂只能够降低U251移植瘤的增殖,而不能象Anti-uPAR单克隆抗体一样抑制肿瘤的生长并能使之缩小。顺铂抑制了uPAR蛋白在U251肿瘤细胞上的表达。结论uPAR与内源性uPA的结合是胶质瘤增殖及其生存的关键所在,针对uPA/uPAR为靶点的治疗方案可能为胶质瘤的治疗开辟一条新的研究思路。

骨关节炎滑膜uPA,uPAR,tPA表达及意义

目的探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)在OA的发生发展中的意义。方法采用免疫组化方法检测滑膜组织中uPA,uPAR,tPA的表达。结果40例OA滑膜中阳性表达uPA31例(775%)、uPAR22例(55%)、tPA37例(925%)。10例对照滑膜中阳性表达uPA2例(20%)、uPAR1例(10%)、tPA8例(80%)。阳性表达主要分布在滑膜衬里层细胞。结论uPA系统可能参与介导软骨降解。促进OA的发生发展;而tPA可能与OA关系不密切。

uPAR在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的功能及机制

【目的】采用RNA干扰(RNAi)技术阻断类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)基因的表达,探讨uPAR基因沉默后对RA-FLS功能产生的影响及有关机制。【方法】收集行关节置换术或滑膜清理术的RA患者的滑膜组织,组织块法培养RA-FLS。通过阳离子脂质体转染的方法,转染体外合成的特异性uPARsiRNA;利用荧光定量PCR法和Western blotting法检测uPAR沉默效果;CCK8法检测细胞增殖抑制率;流式细胞技术检测细胞周期改变;Transwell趋化小室测定细胞的迁移能力;Western blotting技术分析沉默uPAR基因对RA-FLS中PI3K/AKT通路的影响。【结果】uPAR-siRNA能有效阻断RA-FLS中uPAR基因在mRNA和蛋白水平上的表达。沉默uPAR基因后,细胞48、72、96 h增殖抑制率分别为(17.51±2.27)%、(28.62±4.82)%、(22.91±5.78)%,显著高于对照组(P<0.05);uPARsiRNA干扰后,被阻滞于G0/G1期的细胞增加,而S和G2/M期的细胞减少;Transwell趋化小室结果显示:与对照组相比,特异性干扰组的RA-FLS迁移细胞数(35±11)相比空白对照组(138±21)和NC-siRNA组(136±19)明显减少(P<0.05);转染后的RA-FLS相对于对照组,PI3K、AKT、GSK3β的磷酸化水平显著降低(P<0.05)。【结论】uPAR在RA-FLS的增殖、周期及迁移中起重要作用,这可能与其对PI3KAKT通路的激活有关。

uPA、uPAR、nm23-H1在大肠癌中的表达及其与肿瘤侵袭和转移的关系

目的探讨尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(uPAR)和nm23H1基因蛋白在大肠癌中的表达及其与肿瘤侵袭和淋巴结转移的关系。方法应用免疫组化SABC法,对121例大肠癌手术根治标本进行uPA、uPAR和nm23H1基因蛋白测定。结果uPA、uPAR和nm23H1阳性表达率分别为62%、74%和48%。uPA和uPAR高表达与大肠癌侵袭和淋巴结转移关系密切(P<0.05)。nm23H1基因蛋白的低表达与大肠癌分化程度和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。大肠癌中uPA和nm23H1蛋白表达呈负相关(P<0.05)。结论uPA、uPAR和nm23H1基因蛋白表达与大肠癌侵袭和转移有显著相关性;同时检测uPA和nm23H1表达状况,可作为预测大肠癌淋巴结转移及预后的有用指标。

食管癌中uPA、uPAR蛋白表达及其临床意义

目的探讨食管癌中uPA、uPAR蛋白表达与临床病理因素间的关系及其对单纯放疗预后的影响。方法应用免疫组化SP法检测59例食管癌和41例食管癌旁组织中uPA、uPAR蛋白表达情况,分析蛋白表达与临床病理因素间的关系及其对食管癌放疗预后的影响。结果59例食管癌组织中uPA、uPAR蛋白阳性表达率分别为76.27%、77.97%,41例食管癌旁组织中阳性表达率分别为48.78%、43.90%,癌组织和癌旁组织中两种蛋白的阳性表达率比较差异均有统计学意义(P<0.01)。胸部CT扫描显示食管病变层面椎前三角形间隙消失者uPA蛋白强阳性表达率为70.37%,明显高于三角形间隙存在者的43.75%,两者比较差异有统计学意义(P=0.040)。发生远处转移者uPA蛋白阳性表达率比无远处转移者也显著升高,分别为100%和68.89%,两者比较差异有统计学意义(P=0.042)。进一步分析发现uPA、uPAR蛋白表达与食管癌预后未见明显相关性,而uPA、uPAR两种蛋白的表达呈显著性正相关。结论食管癌中uPA蛋白高表达可能与肿瘤局部浸润及远处转移的发生有关。

抗骨增生片对兔骨关节炎滑膜病理形态及uPA、uPAR表达的影响

目的探讨抗骨增生片治疗骨关节炎是否与改变滑膜组织形态以及下调尿激酶型纤溶蛋白酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)的表达有关。方法 30只健康雄性日本大耳白兔随机分成正常对照组、模型对照组,抗骨增生片组。用1.6%木瓜蛋白酶膝关节腔内注射,建立兔膝骨关节炎模型。灌胃4周后,观察滑膜组织病理形态学变化,免疫组织化学法测定uPA、uPAR的表达情况。结果抗骨增生片组滑膜组织病理总积分明显低于模型对照组;抗骨增生片组uPA、uPAR的表达低于模型对照组。结论抗骨增生片治疗膝骨关节炎可能与抑制uPA、uPAR的表达,抑制滑膜炎症的进一步发展,修复滑膜损害有关。

骨关节炎滑膜uPA、uPAR、PAI-1表达及意义

探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)和其抑制剂(PAI-1)在OA的发生发展中的意义。方法:采用免疫组化方法检测OA滑膜组织中uPA,uPAR,PAI-1的表达。结果显示:36例OA滑膜中阳性表达uPA 29例(80.56%)、uPAR 25例(69.44%)P、AI-1 27例(75.00%)。21例对照滑膜中阳性表达uPA 6例(28.57%)、uPAR 6例(28.57%)、PAI-1 3例(14.29%)。实验组与对照组间3种蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05);再将实验组按年龄及软骨破坏程度分组,按年龄分组3种蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05);按软骨破坏程度分组3种蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)。阳性表达主要分布在滑膜衬里层细胞。结论:uPA系统可能参与介导软骨降解、促进OA的发生发展;而PAI-1则通过抑制uPA活性延缓OA的发生发展。

乳腺癌组织中uPA、uPAR及nm23-H1的表达

目的 观察乳腺癌组织中uPA、uPAR、nm2 3 H1的表达并探讨与腋窝淋巴结转移的关系。方法 用免疫组化EnVi sion两步法检测 6 9例乳腺癌组织中uPA、uPAR和nm2 3 H1表达的分布情况 ,观察其与肿瘤的分化程度以及与腋窝淋巴结转移的关系。结果 (1)uPA阳性表达定位于癌细胞胞质 ;uPAR和nm2 3 H1阳性表达定位于癌细胞胞膜及胞质 ,多数癌旁乳腺上皮细胞呈nm2 3 H1阳性表达 ;高分化乳腺癌 (Ⅰ级 )uPA和uPAR表达阳性率 (30 0 %和 2 5 0 %)低于中低分化乳腺癌 (Ⅱ、Ⅲ级 ) (分别为 6 8 1%、72 7%和 70 0 %、74 1%) (P <0 0 5 ) ;nm2 3 H1表达阳性率在乳腺癌组织不同分化程度间差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;(2 )腋窝淋巴结有转移者uPA和uPAR的表达阳性率 (73 2 %和 75 6 %)高于无淋巴结转移者 (35 7%和35 7%) (P <0 0 5 ) ;有腋窝淋巴结转移者nm2 3 H1的表达阳性率 (2 4 4 %)显著低于无淋巴结转移者 (5 0 0 %) (P <0 0 5 ) ;uPA、uPAR和nm2 3 H1的表达与淋巴结转移的个数均无关 ;(3)uPA阳性表达的癌组织其nm2 3 H1表达阳性率 (15 0 %)低于uPA阴性表达的癌组织 (6 2 1%) (P <0 0 5 )。结论 uPA和uPAR的高表达与乳腺癌腋窝淋巴结转移密切相关 ;uPA、uPAR和nm2 3 H1可以作为乳腺癌侵袭与淋巴结转移的?

肝细胞肝癌UPAR和VEGF表达与浸润转移的关系

目的:探讨尿型纤溶酶受体(UPAR)和血管内皮生长因子(VEGF)在肝细胞肝癌(HCC)的表达与其病理学特性和肿瘤浸润转移的关系。 方法:采用抗受体抗体SABC免疫组织化学染色检测79例肝细胞肝癌标本中UPAR表达,以常规SABC免疫组化方法检测VEGF的表达。 结果:在79例HCC中,UPAR的表达阳性率为51.9％(41/79),VEGF的表达阳性率为46.8％(37/79),二者表达与肝癌大小、分化程度无关,但与肿瘤的转移显著相关。 结论:UPAR和VEGF的表达可作为HCC的侵袭表型,可作为估计预后的指标,肝细胞肝癌中VEGF的表达与UPAR表达具有较高的相关性。

皮肤创伤修复中uPA/uPAR的表达及作用的研究

目的 探讨皮肤创伤修复中uPA/uPAR的表达规律及意义。方法 应用免疫组化、WesternBlot、细胞培养、ELISA等方法检测小鼠皮肤伤缘和培养的单层角质形成细胞创伤模型的uPA/uPAR的表达。结果 创伤后uPA/uPAR的表达增高 ,伤后 1 2～ 2 4h为uPA/uPAR的表达高峰。结论 创伤促进了uPA/uPAR的表达 。

AP-1及其相关基因uPA、uPAR在肺癌中的表达及其意义

研究AP-1及其相关基因uPA、uPAR在人肺癌中的表达及其与肺癌临床病理特征的关系.通过免疫组织化学方法检测101例肺癌组织及7例正常肺组织中AP-1、uPA、uPAR的表达情况,利用CMIAS2000型多功能真彩病理图像分析系统测量计算各病例中c-jun、c-fos、uPA、uPAR蛋白阳性细胞的平均光密度(DAO)和积分光密度(DIO).c-jun、c-fos在肺癌组织中表达的阳性率及其共表达率均显著高于正常肺组织;二者在NSCLC的表达显著强于SCLC;不同组织学类型肺癌中二者表达具有显著性差异,腺癌中表达最强,小细胞肺癌中表达最弱;c-jun、c-fos与肺癌分级、合并分期、淋巴结转移均呈显著正相关.uPA、uPAR与肺癌淋巴结转移密切相关,与合并分期呈显著正相关;uPAR与肺癌分级呈显著正相关;各指标之间均存在显著正相关关系.研究结果表明uPA、uPAR参与了肺癌侵袭转移,AP-1信号传导通路在该过程中起了重要调节作用.

猪去氧胆酸对体外培养肝癌细胞HepG2 uPAR的影响

[目的]探讨中药清开灵注射液中主要有效成分之一的猪去氧胆酸对肝癌细胞HepG2上清液中uPAR的影响。[方法]将猪去氧胆酸逐个稀释为从10到30000倍的9个稀释倍数,采用MTT法测定各浓度药液的细胞增殖抑制率,ELISA法检测HepG2细胞uPAR的表达,观察药物各浓度下对细胞生长活力和uPAR表达的影响。[结果]猪去氧胆酸对HepG2细胞具有一定的增殖抑制作用,同时可使细胞培养上清中uPAR水平显著下降。[结论]清开灵注射液降低肝癌细胞uPAR活性表达的能力与其有效成分之一的猪去氧胆酸有关,猪去氧胆酸具有一定体外抑制肝癌细胞HepG2转移的能力。

肝硬化患者血浆uPA、uPAR水平与肝纤维化和癌变的相关性

目的探讨肝硬化患者血浆尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)的表达与肝纤维化及肝癌变的关系。方法对正常对照组(A组)、肝硬化组(B组)及肝硬化并发肝癌组(C组)用ELISA方法测定uPA和uPAR值,同时测定透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(ⅣC)及层粘连蛋白(LN)。结果各组除LN外,uPA、uPAR、HA、ⅣC值由高到低:C组>B组>A组;uPA、uPAR与HA、ⅣC、LN的相关性:(1)B、C组uPA和uPAR呈正相关,r分别为0.594、0.651(P均<0.05)。(2)B组uPA与HA呈正相关r=0.514(P<0.05)。(3)C组uPA与HA、ⅣC呈正相关,r分别为0.715、0.698(P均<0.05)。结论B、C组患者血浆中uPA和uPAR的表达是互动的正向调节;由肝硬化到肝癌,纤维化不断进展;uPA及uPAR的表达与肝纤维化的进行性加剧和肝癌变密切相关。

uPA和uPAR在侵袭性垂体腺瘤中的表达及意义

目的研究尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,uPA)及其特异性受体uPAR在非侵袭性与侵袭性垂体腺瘤中的表达,探讨其与垂体腺瘤侵袭性的关系。方法 61例垂体腺瘤分为侵袭性和非侵袭性两组,采用免疫荧光检测uPA和uPAR的蛋白表达情况,应用RT-PCR检测uPA和uPARmRNA表达水平,并用t检验、2检验,spearman相关分析法分析比较两组肿瘤之间uPA和uPAR的表达差异性。结果在所检测的肿瘤中,31例为侵袭性垂体腺瘤,30例为非侵袭性垂体腺瘤,免疫荧光结果显示在侵袭性垂体腺瘤及非侵袭垂体腺瘤的uPA阳性表达率分别为67.74%和36.67%(P<0.05)、uPAR为58.06%和30.00%(P<0.05),PCR检测结果显示侵袭性垂体腺瘤组与非侵袭组中uPA的相对表达量为0.5468±0.0464和0.4462±0.0305(P<0.05)、uPAR为0.6463±0.0314和0.5464±0.0471(P<0.05)。检测结果显示侵袭性垂体腺瘤组中uPA和uPAR的mRNA及蛋白表达水平明显高于非侵袭组,并且两个指标间存在正相关性(r=0.525,P<0.05)。结论 uPA和uPAR在侵袭性垂体腺瘤中的表达明显上调,说明其可能与垂体腺瘤侵袭性有关。

uPAR在人毛囊发育中的表达及其规律

目的 探讨人胚胎毛囊形成发育进程中 ,尿激酶型纤溶酶原激活剂受体 (uPAR)的表达及其规律。方法 用免疫细胞化学和原位杂交分别对人胚胎毛囊起始期、延长期、分化期和胎毛阶段的表皮及毛囊的uPAR蛋白及mRNA的表达进行了检测 ,用图像分析系统进行了定量测定。结果 uPAR在起始期和延长期的整个毛囊中有表达 ,在分化期和胎毛前期毛囊的外根鞘有表达。在起始期、延长期、分化期和胎毛阶段前期表皮的基底层、最外层细胞有阳性表达。阳性表达在延长期最高 ,呈现出先增后减的趋势。结论 uPAR与角质形成细胞的增殖和迁移密切相关。