基于烟草叶绿体基因组和线粒体基因组SSR标记的烟属植物遗传多样性分析

利用本实验室前期开发的烟草叶绿体基因组和线粒体基因组SSR标记,对属于3个烟草亚属、9个组共35份野生烟草种质资源进行了遗传多样性分析。利用20对SSR引物在35份野生烟草材料中共扩增获得176个多态性条带,每对SSR引物可检测的多态性条带数为2~19个,平均为8.8个。35份材料间遗传相似性系数（GS）在0.20~1.00之间,平均为0.57,表明烟属种间的遗传多样性丰富,遗传差异较大,亲缘关系较远。虽然3个亚属间的界限不明显,但在适当的遗传相似性系数条件下,除香甜烟草组外,35份野生烟草按其组可清晰地聚为7类,表明2种细胞器基因组SSR标记适合用于烟草种间进化、分类、遗传分析等方面研究。

不同烟草品种花粉粒形态的激光共聚焦扫描显微镜观察

对野生烟、烤烟、晒烟花粉进行了激光共聚焦扫描显微镜观察，发现不同品种烟草花粉的形态、大小存在明显的差异，可以做为烟草分类、进化研究的重要依据。

一种烟草对称融合的快捷培养方法

以烤烟K326和野生烟种N.debneyi,N.rustica为亲本,采用酶解法得到其叶肉原生质体,经聚乙二醇、高Ca2+高pH液处理后,进行培养。本实验对原生质体不同的酶解条件、培养方法和不同的培养基进行了研究,融合后的原生质体可在4周后诱导出微愈伤组织。

烟草两种病害抗药性形成和发展的影响因素

为合理防治烟草黑胫病和野火病,减少抗药性产生,减少农药残留,本文就云南省烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗药性,烟草野火病菌对农用链霉素的抗药性形成和发展的影响因素进行了研究。结果表明施药次数的增加与药剂施用浓度的增高,可明显提高烟草黑胫病对甲霜灵抗药性水平。喷药次数的多少与喷药间隔时期可明显影响烟草野火病菌对农用链霉素的抗药性。

烟草野火病病原菌对农用链霉素的抗药性测定

为合理防治烟草野火病,减少抗药性产生,减少农药残留,从云南省8个地州分离烟草野火病菌菌株43个,并就分离菌株对农用链霉素的抗药性进行了测定,结果表明,供试43个菌株中高抗菌株8个,中抗菌株比例较高17个,低抗菌株18个。不同来源的烟草野火病原菌株的抗药性存在差异,文山、昆明的菌株抗药性最高,红河菌株抗药性最低,抗性倍数最高达2000多倍,其余地州抗药性居中。不同地州分离菌株高、中、低抗菌株的比例存在明显差别。分离自文山邱北县双龙营镇的25#菌株抗药性最强,抗性倍数达45907.75,来自文山砚山县阿猛镇租白村的34#菌株抗药性最低。43株烟草野火病菌菌株对农用链霉素的EC50值平均为4.65,范围在0.004～183.631。高、中、低抗菌株的平均抗性倍数分别为6124.69、49.72、6.40。

烟草野生种eIF4E1-S同源基因的多样性与马铃薯Y病毒抗性分析

【背景和目的】在栽培烟草中,真核生物翻译起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 4E1,eIF4E1-S)的缺失或突变能够抗马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)侵染。为了解烟草野生种eIF4E1-S同源基因的多样性和PVY抗性状况,预测野生种含有抗PVY新基因(即不同于eIF4E1-S基因缺失或突变的基因)的可能性。【方法】本文设计了普通烟草eIF4E1-S和其同源基因eIF4E1H-T(非感病基因)的特异引物,扩增测定了34个烟草野生种的同源基因cDNA序列,分析了野生种PVY抗性与感马铃薯Y病毒属病毒eIF4E蛋白关键结构域序列(loop1和loop2)的相关性。【结果】在eIF4E1-S同源基因的系统进化树上,绒毛烟草组(Tomentosae)的4个抗PVY野生种Nicotiana otophora、N.setchelli、N.tomentosa、N.tomentosiformis聚成一组,loop1和loop2的氨基酸序列与eIF4E1H-T一致,这4个野生种对PVY的抗性可能与eIF4E1进化为eIF4E1H-T有关、包含抗PVY新基因的可能性较低。圆锥烟草组(Paniculatae)的4个抗PVY野生种N.benavidesii、N.raimondii、N.cordifolia、N.knightiana聚成一组,同源基因氨基酸序列与eIF4E1-S一致率高于eIF4E1H-T,但loop1和loop2氨基酸序列相互之间差异较大,这4个野生种包含抗PVY新基因的可能性中等。与eIF4E1-S聚成一个小分支的N.glauca、N.noctiflore、N.africana高抗5个PVY分离物(包含可克服va抗性的PVY分离物),其中N.glauca、N.noctiflore的同源基因loop1氨基酸序列与eIF4E1-S相同,loop2与eIF4E1-S之间只有1-2个氨基酸差异,N.africana同源基因loop1与eIF4E1-S和eIF4E1H-T差异较大、loop2与eIF4E1-S之间只有1个氨基酸差异(V97M)。推测这3个野生种的PVY抗性与eIF4E1的突变无关且含有新的抗PVY基因可能性高,可作为重点抗源研究利用。【结论】根据PVY侵染栽培烟草所利用的寄主因子eIF4E1-S基因的同源基因的多样性,抗PVY烟草野生种存在抗PVY新基因的可能性划分为高、中和低三档。N.glauca、N.noctiflore、N.africana含有新的抗PVY基因可能性高于其他供试野生种。

K营养对烤烟叶片中几种抗性物质及野火病发生的影响

通过对云南中部地区不同生长状况、不同发病程度的34个烤烟样品的钾、总酚、类黄酮含量分析和田间病害调查,结果表明:烟叶一般K含量为1%-4%,K含量高于4%的较少,无低于1%的样品;在K含量为2%-4%的范围内,随钾含量的增加,总酚、类黄酮含量提高,过氧化物酶活性增强,烤烟野火病病情逐渐减轻;K含量>4%及<2%时,总酚、类黄酮含量降低,过氧化物酶活性减弱,野火病发病严重。

野生烟种质资源的遗传多样性分析及抗病性鉴定

为了提高野生烟种质资源的开发利用效率,本研究利用表型性状和SSR分子标记技术对30份野生烟种质资源进行遗传多样性分析。结果表明,30份种质资源表型性状具有丰富的变异类型,遗传多样性指数(H′)的变幅为0.831~1.955,其中节距的多样性指数最高,叶宽和叶长次之。16对SSR引物共检测到98个等位基因,平均为6.125,Shannon信息指数(I)、期望杂合度(He)、观测杂合度(Ho)、多态性信息含量(PIC)的均值分别为1.5425、0.7596、0.2404、0.8668。聚类分析和群体结构分析显示供试材料可分为4个类群,分类结果大致相同,各类群聚集的地域性规律较明显。利用这16对引物构建了30个野生烟种质的指纹图谱,为野生烟种质资源鉴定体系的研究奠定理论基础。抗病性鉴定发现,N.exigua Wheeler等7份种质表现为抗黑胫病;N.nesophila Johnston高抗青枯病,N.debneyi Domin和N.stocktonii Brandegee抗青枯病;N.alata Link&Otto等5份种质对烟草花叶病免疫;N.alata Link&Otto等9份种质抗黄瓜花叶病;N.debneyi Domin等15份种质抗马铃薯Y病。本研究可为野生烟种质资源的鉴定评价、种质创新和优异基因发掘奠定基础。

人野生型p53肿瘤抑制基因在烟草中的遗传转化

目的:构建人野生型p53肿瘤抑制基因的植物表达载体,并建立p53转基因烟草植株.方法:将人野生型p53肿瘤抑制基因编码区克隆于pUC19,pBI426和pCAMBIA2301载体,构建含人野生型p53基因的植物表达载体pCAM-BIA2301/p53,p53基因由2×CaMV35S启动子控制表达.利用叶盘共培养法经根瘤农杆菌EHA105介导转化烟草,获得转基因烟草植株;用组织化学法,PCR、Southern杂交检测转基因烟草植株.结果:经组织化学法,PCR,Southern杂交检测表明人野生型p53基因已整合到转基因烟草植株的基因组中,并获得了的转p53基因烟草植株.结论:成功建立了含人野生型p53基因的转基因烟草植株,为进一步检测p53基因的生物活性和开辟生产药用蛋白的新途径奠定了基础.

烟草野生种资源对青枯病的抗性

为烟草野生种资源在抗青枯病育种方面的应用提供参考,以64个烟属野生种和4个普通烟草栽培种为试验材料,采用青枯病苗期接种鉴定和田间病圃鉴定相结合的方法,研究烟草野生种资源对青枯病的抗病性。结果表明:高抗青枯病野生种6个,抗青枯病野生种12个,中抗青枯病野生种17个;烟属分类系统下N.sect.Repandae和N.sect.Paniculatae组内野生种的青枯病抗性较强,普通烟草祖先种所在N.sect.Tomentosae和N.sect.Sylvestres组的野生种青枯病抗性较差。

烟草野火病防治技术研究

根据烟草野火病的发生特点,选择低毒或营养调控药剂,按独用或混用的方式设置田间试验研究野火病的最佳防治方案。结果表明:在烟草团棵期以前,当野火病零星发生时,按首次20%噻菌铜悬浮剂1 000倍液,第二次1%诺尔霉素水剂1 000倍液+能量金800倍液+斯德考普1 500倍液,第三次20%噻菌铜悬浮剂1 000倍液,均叶面喷雾,每次施药液600 kg/hm^2,间隔期10 d的方式进行处理,能有效控制团棵前野火病的发生。在烟草现蕾以后,当野火病零星发生时,按首次20%噻菌铜悬浮剂+40%菌核净可湿性粉剂,第二次20%噻菌铜悬浮剂,第三次1%诺尔霉素水剂,均稀释1 000倍液叶面喷雾,每次施药液750kg/hm^2,间隔期10 d的方式进行处理,能有效控制现蕾后野火病的发生。

野茄子叶挥发油化学成分分析及其在卷烟中的应用

试验采用同时蒸馏萃取法提取野茄子叶中挥发性成分,用全二维气相色谱-飞行时间质谱对挥发油化学成分进行分离鉴定,共鉴定出匹配度较高的化学成分322种,包括40种醇、41种醛、5种酸、2种内酯、87种烷烃、21种烯烃、67种酮和10种酯等。感官评吸结果表明:野茄子叶挥发油无论是直接加入卷烟中还是以涂布液的方式加入烟草薄片中,均能与烟香协调,提高香气量、降低刺激和热辣感,提高舒适性,烟气状态得到明显改善。

烟草祖先种及重要野生种叶绿素酶基因CLH1的生物信息学分析

叶绿素酶(Chlorophyllase)是所有光合生物叶绿素代谢中最重要的酶之一。叶绿素酶催化叶绿素的水解,产生脱植基叶绿素和叶绿醇。以烟草祖先种和重要野生种为研究对象,以拟南芥CHLOROPHYLLASE 1 (CLH1)为探针,通过同源序列搜索,从数据库中获取普通烟草(Nicotiana tabacum)及祖先种、烟草属重要野生种中的CLH1基因及其蛋白序列,并通过生物信息学分析手段对其编码蛋白的理化特性、氨基酸序列特征、蛋白结构与功能、启动子序列及表达调控特征进行了分析,并以林烟草(Nicotiana sylvestris) Nsyl CLH1为代表,预测了该基因启动子的顺式作用元件,以渐狭叶烟草(Nicotiana attenuata) Natt CLH1为例,预测了该基因的编辑位点。结果表明,栽培烟草CLH1蛋白虽在理化特性上存在差异,但氨基酸序列分析表明这些序列高度相似;对林烟草Nsyl CLH1基因的启动子顺式作用元件分析显示,除光响应作用元件、抗病性作用元件、干旱和盐分等作用元件,还有与茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,Me JA)、赤霉素(Gibberellic acid,GA)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)和水杨酸(Salicylic acid,SA)等激素响应相关的元件,表明Nsyl CLH1基因的表达水平受多种因素的影响。最后,基因编辑位点预测显示渐狭叶烟草Natt CLH1可能跨越外显子-外显子连接。为茄科烟草属植物CLH1基因的功能研究、基因编辑及品质育种等提供了理论基础。

拮抗菌群对烟草野火病的防治效果及叶际微生物群落多样性的影响

【背景】烟草野火病(Tobacco Wild Fire)是烟草上的主要病害之一,利用拮抗菌防治烟草野火病是具有较好前景的防治手段。【目的】分析烟草叶际微生物群落结构组成和多样性,阐释拮抗菌群施用对烟草野火病的防治效果及对叶际微生物群落的影响。【方法】在烟草上施用3种拮抗菌群,采用16Sr RNA基因高通量测序及生物信息学手段,分析拮抗菌群对烟草叶际微生物群落结构组成和多样性的影响,研究拮抗菌群在叶片上的定殖。【结果】拮抗菌群对烟草野火病的防治效果达到50.44%-68.58%。与对照相比,3种拮抗菌群处理叶际微生物群落结构和组成都产生了明显的变化,群落多样性显著增高。拮抗菌群处理后,烟草叶际微生物泛菌(Pantoea)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)和假单胞菌(Pseudomonas)等菌属所占比例发生显著变化,其中芽孢杆菌属(Bacillus)和寡养单胞菌属相比对照增加分别达到3.9倍和7.02倍,其丰度与病情指数显著负相关。【结论】拮抗菌群对烟草野火病有较好的防治效果,施用拮抗菌群显著影响叶际微生物群落的组成和多样性,假单孢杆菌和寡养单胞菌等优势菌属能够在烟草叶际定殖,起到防治烟草野火病的作用。

过表达硒代半胱氨酸甲基转移酶烟草的硒耐受特性分析

以经鉴定的硒代半胱氨酸甲基转移酶(Selenocysteine methyltransferase,SMT)转基因烟草(Nicotiana tabacum L)和野生型烟草(NC89)为材料,置于添加不同质量浓度(0、20、40和60 mg/L)硒酸钠的MS培养基上进行培养,35 d后分别测定两种处理材料的过氧化物酶活性、叶绿素、鲜质量和株高等生理生化指标.结果表明:在不同质量浓度硒酸钠处理后,SMT转基因烟草和野生型烟草的叶绿素质量分数、鲜质量及株高均较各自对照明显下降,比较而言,野生型烟草的下降幅度明显大于转基因烟草;另一方面,野生型烟草过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性表现强烈的应激反应,其活性明显高于转基因烟草.生长生理与表型特性表明SMT转基因烟草具有一定的硒耐受性.