外套细胞淋巴瘤bcl-1/IgH基因重排的检测与序列分析

目的 :寻找一种敏感、特异而又快捷的方法检测外套细胞淋巴瘤中 bcl- 1/ Ig H 基因重排 ,并分析 bcl- 1/Ig H 基因重排产物的序列 ,以了解 bcl- 1/ Ig H 基因重排发生的确切机理。方法 :对 2 8例经临床确诊的外套细胞淋巴瘤的新鲜冰冻组织 ,通过半巢式 PCR检测 bcl- 1/ Ig H基因重排 ,并对 bcl- 1/ Ig H基因重排产物进行克隆和序列分析。结果 :通过半巢式 PCR测到有 bcl- 1/ Ig H基因重排者计 17/ 2 8例。而采用一步法 PCR仅 9例有此基因重排 ,两者相比 ,差异显著 (χ2 =4 .59,P<0 .0 5)。对 bcl- 1/ Ig H基因重排产物进行序列分析后发现 ,bcl- 1/ Ig H基因重排产物为 74～ 16 2 bp大小 ,融合基因连接区为 6～ 2 4 bp大小。在断裂点集中的 6 5bp范围内 ,找到 10个不同的断裂点 ,其中 5个未见文献报道。对 JH 基因序列的分析 ,发现 bcl- 1/ Ig H 基因重排时 ,JH1,JH3,JH4 ,JH5和 JH6都可能参与重排 ,其中 ,以 JH4多见 ,而 JH2则没有涉及。结论 :该半巢式 PCR方法是检测外套细胞淋巴瘤中 bcl- 1/ Ig H基因重排的一种敏感而特异的方法 ,对外套淋巴细胞淋巴瘤的明确诊断和治疗都有一定的指导意义 ,而对 bcl- 1/Ig H基因重排的序列分析 ,则将为外套细胞淋巴瘤的的发病机理研究提供理论依据。

TTV在黑龙江省不明原因肝炎患者中的比例及其致病性

目的 研究一种肝炎病毒 (输血传播病毒 ,TTV)在黑龙江省不明原因肝炎患者中的比例、疾病的发展过程及健康人的携带情况 ,以探讨输血传播病毒的致病性。方法 采用半套式 聚合酶链反应 (semi nestedPCR)方法对不明原因性肝炎患者 ,包括 4 5例急性肝炎、2 7例慢性肝炎、8例重型肝炎 ,11例健康志愿献血员进行TTV的定性检测。对 9例经过第一步检测TTV DNA阳性的急性恢复期患者行再次检测。结果 80份不明原因性肝炎患者血清中 15份TTV阳性 ,占 18.75 %。其中急性肝炎患者血清中检出 9份TTV阳性 ,占 2 0 % ;慢性肝炎患者血清中检出 5份TTV阳性 ,占 18.5 2 % ;8份重型肝炎中检出 1份TTV阳性 ,占 12 .5 %。其中 9份TTV阳性的急性不明原因性肝炎患者在恢复期采集的第 2份血清TTV检测结果均为阴性。 11份健康志愿献血员的血清中没有检出TTV DNA。结论 输血传播病毒具有致病性。可以引起急性、慢性、重型肝炎 ,临床表现与甲 戊型肝炎的临床表现没有明显区别。急性TTV病毒性肝炎可以痊愈。

新疆维吾尔族妇女宫颈癌中HPV16感染和p53蛋白表达的相关性研究

采用半巢式PCR法检测 80例新疆维吾尔族宫颈癌及 3 4例正常宫颈组织中HPV16DNA ,采用免疫组化法检测p5 3蛋白 ,分析其与宫颈癌发生的相关性 ,探讨HPV16感染和p5 3蛋白表达在新疆维吾尔族妇女宫颈癌发生中的作用。结果显示 :HPV16检出率在宫颈癌中为 80 .0 % ,与对照组 8.8%相比 ,存在显著性差异 ( χ2 =4 9.88,P <0 .0 0 5 ) ;宫颈癌组织中p5 3蛋白表达阳性率为 6 2 .5 % ,也明显高于对照组 ,P <0 .0 0 5 ;p5 3蛋白表达与HPV16感染在统计学上无相关 ( χ2 =0 .0 ,P >0 .0 5 )。表明 :HPV16感染与新疆维吾尔族妇女宫颈癌发生密切相关 ;HPV16感染的宫颈癌组织中p5

转基因玉米59122品系的特异性检测

使用反向聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了转基因玉米59122的外源基因与玉米基因组之间的两段侧翼序列,并据其左侧侧翼序列设计了具品系特异性的引物,运用半巢式PCR技术建立了59122的品系特异性二重PCR检测方法,扩增片段100bp,横跨pat终止子与转基因玉米侧翼基因之间。以转基因玉米59122、MON863、MON810、GA21、NK603,转基因大豆Roundup Ready和转基因油菜GT73等为材料,证明本方法与其他转基因作物具有高特异性。本方法在检测59122时,确定出连接体系中线性DNA的最佳质量浓度为1ng/μL左右,检出限达到0.1%,灵敏度为38个单倍体基因组拷贝数。因此可准确、快速、高效地检测转基因玉米及其产品,或作为常规PCR定性检测后的验证方法。

用PCR诊断不同虫荷量的大鼠卡氏肺孢子虫肺炎的价值

目的 评价在不同虫荷量条件下用 PCR诊断大鼠卡氏肺孢子虫肺炎 (PCP)的价值。 方法 将 PCP大鼠随机分为药物治疗组及未治疗组 ,测定其肺虫荷量 ,收集其支气管灌洗液 (BAL F)和血清标本 ,用 PCR和半套式 (Sn) PCR检测标本中的卡氏肺孢子虫基因 ,比较 PCR和环六亚甲基四胺银 (GMS)染色结果 ,及与病鼠肺虫荷量的关系。 结果 虫荷量高的未治疗组病鼠的 BAL F标本 PCR、Sn PCR及 GMS染色阳性率分别为 10 0 %、10 0 %和 92 .6 % ,差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;而虫荷量低的治疗组的 PCR(88.1% )、Sn PCR(94 .9% )阳性率均显著高于 GMS染色镜检阳性率 (30 .5 % ) (P<0 .0 5 )。肺虫荷量 >5 0 0个 /mg肺的 PCP大鼠 ,血清 PCR阳性率显著高于≤ 5 0 0者 (分别为 4 2 .9%和 1.7% )。 结论 PCR可用于虫株负荷量较低时的 PCP诊断 ,对判断 PCP病情及疗效考核亦有一定的帮助。

半巢式聚合酶链反应在浆膜腔细菌感染诊断中的初步应用

目的观察革兰分型半巢式聚合酶链反应(PCR)在浆膜腔细菌感染诊断中的应用价值。方法对30例浆膜腔积液标本,以细菌16SrRNA基因为靶序列,采用一对通用引物和一条革兰阴性菌特异性引物,以半巢式PCR方法进行检测,并同时作细菌培养。结果以通用引物对30例标本作第1次PCR,11例扩增出371bp长度的DNA片段,阳性率为36.7%;对阳性PCR产物再以革兰阴性菌特异性引物作第2次PCR,9例扩增出353bp的DNA片段即为革兰阴性菌。对此30例标本作细菌培养,阳性率为16.7%,低于PCR扩增法。5例标本细菌分离结果与半巢式PCR革兰分型结果相同。结论革兰分型半巢式PCR方法能够灵敏地检测细菌并作出革兰阴性、阳性分型,对于浆膜腔感染的早期诊断具有较好的应用价值。

单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ半巢式PCR检测方法的建立和在病毒性脑炎诊断中的应用

为进一步提高 PCR诊断方法的特异性和敏感性 ,在单纯疱疹病毒 ( HSV) TK基因区设计了一对外层公用引物和两个内层分型引物 ,建立了半巢式 PCR检测和分型 HSV的方法。用该方法检测了天津地区 64例病毒性脑炎患者 (病脑组 )和 4 6例其他中枢神经系统疾病患者 (对照组 )的脑脊液 ( CSF)标本。病脑组了阳性率为 1 5.63% ( 1 0 / 64) ,其中 9例为 HSV-1感染 ,1例为 HSV-2感染。对照组阳性率为 2 .1 7% ( 1 / 46)。本方法在发病后第 1天即可测出 CSF中的 HSV DNA,敏感性为 0 .0 1 TCID50 。

新疆喀什、库尔勒及石河子地区维吾尔族妇女宫颈癌HPV16感染率对比

为探讨新疆喀什、库尔勒及石河子地区维吾尔族妇女宫颈癌患者中HPV16感染率的差异.采用半巢式PCR技术对152例维吾尔族妇女宫颈癌石蜡组织中HPV16DNA进行检测.结果显示在喀什、库尔勒及石河子地区妇女宫颈癌组织中,HPV16DNA检出率分别为80%,80%及53.1%,在统计学上有差异(x2=9.566,P=0.008);喀什及库尔勒地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16感染率高于石河子地区(x2=8.247,P=0.004;x2=5.906,P=0.015).因此,新疆喀什、库尔勒及石河子地区维吾尔族妇女宫颈癌患者中HPV16感染有所不同.

快速检测细菌并革兰分型的半巢式聚合酶链反应及其初步应用

目的以半巢式聚合酶链反应(PCR)检测细菌及作革兰阴、阳性分型,并与细菌培养法比较。方法以细菌16SrRNA基因为靶序列,采用一对通用引物(pm1,pm3)和一条革兰阴性型特异性引物(pm2),以半巢式PCR方法扩增实验室保留菌株的DNA并作出革兰染色分型;以人类外周血白细胞基因组DNA、HBVDNA阳性血清以及白假丝酵母菌为对照,检测此方法的特异性;采用倍比稀释菌液作敏感性实验;与细菌培养法比较,验证此方法检测临床标本的敏感性。结果对17个实验室保留菌株进行检测,以通用引物对作第1次PCR均得到371bp长度的DNA片段;再以革兰阴性菌特异引物对(pm2,pm3)作第2次PCR,9种阴性菌均得到353bp的DNA片段,而8种阳性菌未被扩增。特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应。敏感性实验表明,采用半巢式PCR可检测出3个CFU的细菌。对120份临床标本检测,半巢式PCR检测阳性率(29.2%)显著高于细菌培养法检测阳性率(17.5%)。结论此半巢式PCR检测细菌方法,具有特异、敏感、快速的特点,并能对细菌进行革兰阴性、阳性分型,可用于临床感染性疾病的初步诊断。

河北地区TT病毒感染与不同型别病毒性肝病的关系

目的分析健康人群及肝病患者TTV感染状况。方法采用TTV（N22）区核苷酸序列设计引物，建立半巢式聚合酶链反应（Semi—nested PCR）方法，对309例7种不同人群血清检测TTV DNA。结果TTV在非甲一非戊型肝炎、肝硬化患者、丙型肝炎、急性甲型肝炎、急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎和健康人群中感染率分别为75．00％（15／20）、75．00％（27／36）、61．90％（13/21）、58．06％（18／31）、52．78％（38／72）、45．61％（26／57）和38．89％（28／72）。肝硬化患者及非甲非戊型肝炎感染率明显高于健康人群（P〈0．01），也明显高于急、慢性乙型肝炎患者（P〈0．05）。21～30岁年龄组TTV感染率（39．06％）显著低于51～60岁年龄组感染率（68．75％）（P〈0．01），其他年龄间无差异。急性甲型肝炎、急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎与丙型肝炎之间无统计学意义，性别之间亦无统计学意义。结论TTV在河北地区健康人群及肝病患者中有较高的感染率，TTV感染与不明原因ALT升高有一定的关系。

Sn-PCR在脑脊液中未知肠道病毒鉴定中的应用

目的利用肠道病毒分子定型试验,对病毒性脑炎患儿的脑脊液标本进行分子型别鉴定。方法提取患儿脑脊液核酸,利用半巢式聚合酶链反应(Sn-PCR)对肠道病毒VP1区进行特异性扩增并进行序列测定,通过BLAST比对确定肠道病毒的类型,采用Mega6.0软件构建基因进化树。结果 BLAST比对显示该病毒是肠道病毒中的柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus group B5,CVB5)。从进化树上看,青海分离株04/CVB5/2010/Qinghai/CHN由2009年山东分离株SD2009-067不断演变而来,而与分离株AH-HK19/CHN/2010/CVB5不在同一进化分支,相距甚远,与FJLY/2011096h分离株亲缘性关系较近。结论成功应用Sn-PCR对患儿脑脊液中未知肠道病毒进行鉴定,确定肠道病毒类型是CVB5型,为肠道病毒引起的脑炎疾病的防控提供参考。

乙型肝炎病毒B基因亚型（Ba，Bj）半巢式PCR检测方法的建立

目的建立一种灵敏特异且简便易行的乙型肝炎病毒（HBV）B基因Ba和Bj亚型分型方法。方法用DNAStar软件比较分析GenBank中登录的B基因型HBV（HBV／B）和C基因型HBV（HBV／C）的基因序列，分别设计出HBv／B型特异性引物HB及Ba和目基因亚型特异性引物BA和BJ。第一轮PCR反应以HBV／B型特异性引物HB作为上游引物，以日本学者Sugauchi等设计的引物HBAS-4V作为下游引物（外引物）；第二轮PCR反应同样以HB作为上游引物，亚型特异性引物BA和BJ作为下游引物（内引物），在同一个反应管中进行。根据PCR产物片段的大小判定B基因亚型。随机选取实验室内经型特异性引物PCR法鉴定为HBv／B（56份）及经preS／S区序列测定证实为HBV／C（15份）的HBV慢性感染者血清标本共71份，以研究设计的引物进行半巢式PCR反应，检测Ba和Bj基因亚型，并以载有HBVBi亚型基因组的质粒作为尉亚型的阳性对照。然后随机选取15份B型样本的第一轮PCR产物直接测序，利用Blast和DNAStar软件将测序结果与GenBank中登录的Ba及Bj亚型序列进行同源性分析，验证该半巢式PCR法的准确性。结果56份HBV／B血清标本经该半巢式PCR法检测，均为Ba亚型，随机选取的15份B型PCR产物直接测序，结果均为Ba亚型，与研究中应用的半巢式PCR方法检测结果一致。15份HBV／C的血清标本检测结果均为阴性。结论建立了HBVBa和Bi亚型半巢式PCR法。该方法灵敏、特异、简便、易行，可用于临床和流行病学大样本检测。