抗人LSECtin单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：制备抗肝脏、淋巴结窦内皮细胞C型凝集素（LSECtin）单克隆抗体（mAb），并进行特性鉴定。方法：采用原核表达的LSECtin免疫BALB／c小鼠，以间接ELISA法筛选分泌特异性mAb的杂交瘤细胞，采用蛋白印迹、间接免疫荧光、流式细胞术和免疫组化染色法鉴定mAb的特异性。结果：共获得8株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。mAb的Ig亚类均为IgG，效价达1：10^6-1：10^7。这些mAb均可识别转染3T3细胞膜上的人LSECtin，6株mAb可特异识别肝脏窦内皮细胞。结论：成功地制备8株抗LSECtin的mAb，经免疫印迹、流式细胞术和免疫组化染色检测，这些mAb的特异性良好，为研究LSECtin的功能提供了有力的试剂。

LSECtin-CRD-GST融合蛋白的原核表达、纯化及复性

目的:构建C型凝集素LSECtin主要功能结构域CRD的原核表达载体,在大肠杆菌中表达LSECtin-CRD-GST融合蛋白。方法:根据Gen Bank发布的LSECtin基因序列设计引物,利用基因重组技术将获得的LSECtin-CRDc DNA定向克隆至C端带GST蛋白标签序列的融合表达载体p GEX-6p-1中,转化大肠杆菌Origami(DE3)进行重组蛋白的诱导表达,用GST柱亲和纯化融合蛋白。结果:获得了原核表达载体p GEX-6p-1-LSECtin-CRD,诱导表达出大量相对分子质量约40×103的包涵体融合蛋白,经纯化、复性获得可溶蛋白,经Western印迹鉴定为目的蛋白。结论:获得足量的LSECtin-CRD-GST融合蛋白,为进一步研究CRD蛋白结构域的动态构象变化提供了实验材料。

肝窦内皮细胞凝集素抑制肝星形细胞增殖、胶原合成与分泌的实验研究

目的:探讨肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)对肝脏星形细胞(HSCs)增殖和胶原分泌的影响。方法:离体培养大鼠肝星形细胞系HSC-T6,分为对照组和LSECtin处理组。采用噻唑蓝(MTT)比色法和[~3H]-胸腺嘧啶核苷(H^3-TdR)掺入法检测HSC-T6细胞的增殖情况,分别采用[~3H]-脯氨酸掺入法和比色法检测HSC-T6细胞胶原合成与分泌的情况。结果:LSECtin剂量依赖性的抑制HSC-T6细胞增殖,其中10^(-7)mol/L的LSECtin对HSC-T6细胞增殖的抑制率为50%。另外,LSECtin对于HSC-T6细胞胶原的合成与分泌也有显著地抑制效应,并呈剂量关系。其中,10^(-7) mol/L的LSECtin对HSC-T6细胞胶原合成与分泌抑制率分比为55%和52%。结论:LSECtin是肝星形细胞的增殖、胶原合成与分泌的抑制因子,对于肝纤维化具有潜在的治疗价值。

一种改良的小鼠肝窦内皮细胞的分离、纯化、培养及鉴定方法

采用改进的胶原酶灌注方法结合Percoll密度梯度离心加anti-LSE Cmicrobeads免疫磁珠分离纯化小鼠肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs),台盼蓝染色测定细胞活力,光镜下观察培养细胞的形态学变化,流式细胞仪分析其纯度,RT-PCR方法检测其新的特征性分子LSECtin基因的表达。结果表明:此方法分离的小鼠LSECs得率为(5±0.2)×106个/只小鼠,台盼蓝染色活力≥95%,流式细胞仪分析其纯度达到91.92%,光镜下观察细胞形态典型,RT-PCR检测到新的特征分子LSECtin基因的表达。本研究建立了一种小鼠LSECs的分离、纯化、培养及鉴定方法,为其功能和作用机制的深入研究打下了基础。

用SDSL-EPR技术测量LSECtin-CRD与甘露糖结合过程中的位点运动性变化

目的:应用定点自旋标记-电子顺磁共振(SDSL-EPR)技术检测肝脏及淋巴结窦内皮细胞C型凝集素(LSECtin)的糖基识别结构域CRD上不同位点氨基酸的运动特性及其与甘露糖结合过程中的构象变化。方法:通过SOE-PCR方法对LSECtin-CRD引入半胱氨酸点突变,构建p ET28b-Tat-LSECtin-CRD载体,可溶性表达LSECtin-CRD突变体蛋白;对突变位点进行自旋标记;EPR检测标记后样品的EPR波谱;用SS-FDDM软件对EPR波谱进行模拟和解析,获得旋转相关时间τc,研究其构象特点及变化。结果:在CRD的Ca^(2+)结合位点和配体结合功能区构建了5个突变体蛋白;LSECtin-CRD与Ca^(2+)和甘露糖结合后,4个位点的τc值明显升高,表明CRD结构域整体运动性降低;5个突变位点运动性差异较大,其中A258位点运动性变化最大,可能是参与糖基结合的关键位点。结论:SDSL-EPR技术能够有效研究LSECtin-CRD参与糖基结合过程中的构象运动性,研究结果证明了LSECtin-CRD在与糖基结合后整体运动性受限。

小鼠抗人LSECtin单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定小鼠抗人LSECtin(肝、淋巴结窦内皮细胞凝集素)单克隆抗体,为深入研究其功能奠定基础。方法利用CHO细胞制备人LSECtin-His融合蛋白,将其作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过电融合获得能产生人LSECtin单克隆抗体的杂交瘤细胞。用LSECtin重组蛋白作为检测原,筛选分泌LSECtin单克隆抗体的杂交瘤细胞株。分别通过流式检测和Western印迹实验(WB),对LSECtin单克隆抗体进行鉴定。结果获得分泌LSECtin单克隆抗体的杂交瘤细胞系。流式细胞术结果显示,共有5株抗体可特异性识别细胞表面表达的LSECtin;有2株可用于WB实验。结论获得了能应用于流式细胞术和WB实验的LSECtin单克隆抗体,为LSECtin的功能性研究奠定了基础。

肝脏免疫调控蛋白LSECtin-CRD突变体可溶性表达及其活性分析

目的构建肝脏及淋巴结窦内皮细胞C型凝集素糖基识别结构域(LSECtin-CRD)双半胱氨酸(Cys)突变体原核表达载体,获得LSECtin-CRD突变体蛋白,并鉴定其生物学活性。方法基于LSECtin-CRD的三维结构模型选择突变位点;通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)对LSECtin-CRD基因引入Cys点突变,构建pET28b-Tat-LSECtin-CRD突变体载体;IPTG诱导可溶性表达LSECtin-CRD突变体蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白质表达水平;亲和层析方法对突变体蛋白进行纯化;通过检测突变体蛋白的甘露糖和GlcNAc结合能力鉴定其生物活性。结果菌液PCR和测序结果表明LSECtin-CRD双Cys突变体G205C-A227C和G205C-D279C原核表达载体构建成功,SDS-PAGE结果显示两个突变体蛋白均实现高效可溶性表达,单糖结合试验结果显示两个突变体蛋白均具有良好的生物学活性。结论本研究获得了具有生物学活性的LSECtin-CRD双Cys突变体蛋白,为进一步研究LSECtin-CRD结构和功能关系提供实验依据。