α-苦瓜素对巨噬细胞炎性细胞因子风暴的选择性抑制作用

目的α-苦瓜素(α-momorcharin,α-MMC)能受体依赖性靶向作用于单核细胞,调节其细胞因子表达而发挥免疫调节作用,但对巨噬细胞是否具有选择性调节作用尚不清楚。本实验通过细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的M1型炎性巨噬细胞模型,观察α-MMC对其炎性细胞因子风暴的抑制作用,并探讨其可能的靶向作用机制。方法Western blot法检测WIL2-S B淋巴细胞、H9 T淋巴细胞、THP-1单核细胞和M0巨噬细胞LRP1受体蛋白表达;CCK-8法检测4种细胞的生存率;ELISA检测M1巨噬细胞炎性细胞因子的表达水平;Western blot法检测M1巨噬细胞TLR4信号通路相关蛋白的表达。结果巨噬细胞具有与单核细胞一致的高密度LRP1受体;α-MMC在4个细胞上的存活率与该受体的密度呈正相关;α-MMC以剂量和时间依赖性抑制M1巨噬细胞的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1α和MCP-1表达;α-MMC对TLR4信号通路的TAK1/p-TAK1、p-JNK、p-AP1和p-p65信号蛋白有明显的抑制作用,这种抑制作用能被LRP1受体阻断剂阻断。结论α-MMC通过LRP1受体介导,抑制TLR4信号通路的TAK1,进而抑制下游NF-κB和MAPK通路,从而选择性抑制巨噬细胞炎性细胞因子表达。α-MMC对巨噬细胞的选择性免疫抑制作用可能使其成为治疗急性感染巨噬细胞激活综合征(macrophage activation syndrome,MAS)的非常有前途的药物。

苦瓜α-苦瓜素基因启动子克隆与单倍型分析

为探明α-苦瓜素基因的表达调控规律,从苦瓜种质Y5中克隆了α-苦瓜素基因上游包括起始密码子在内的1 620 bp序列,选取转录起始位点上游1 500 bp序列,利用Plant CARE在线启动子预测工具进行分析。结果表明,α-苦瓜素启动子除了含有TATA-box和CAAT-box等核心元件外,还含有光响应元件、赤霉素响应元件、热胁迫响应元件、干旱应答元件、水杨酸应答元件、茉莉酸应答元件等。以28份苦瓜种质为材料,分析了α-苦瓜素启动子区域SNP和In Del分布情况,共发现24个SNP位点和1个In Del,28份苦瓜种质资源共存在4种单倍型。3个SNP位于转录因子结合位点,可能对α-苦瓜素基因的表达调控有重要作用。

苦瓜籽蛋白的分离纯化及免疫原性分析

经过NaCl溶液匀浆抽提、硫酸铵分级分离、SP-SepharoseFastFlow层析、SephacrylS-100层析、Macro-Cap-SP层析,从苦瓜籽中同时分离纯化出大量的α-苦瓜素和苦瓜抗HIV蛋白30。经SDS-PAGE鉴定,二者均为单一条带,表观分子量为28kDa。用两种蛋白分别免疫Balb/c小鼠,双向免疫扩散表明,两种苦瓜籽蛋白无交叉反应。本实验为进一步探索PEG修饰MAP30免疫原性变化打下了基础。

α苦瓜素对大鼠长期毒性实验的血液学指标分析

目的探讨长期毒性实验中α苦瓜素(α-MMC)对大鼠的血液学影响。方法将SD大鼠随机分为生理盐水对照组、α苦瓜素各剂量组(6.25,2.08,0.70mg/kg),隔日经尾静脉注射给药一次,连续28天,停药后恢复14天,分别在给药期末和恢复期末进行血液常规检查、流式细胞分析和骨髓象检查。结果连续给予大鼠α苦瓜素28天后,随着剂量的增加,WBC、LYM、RBC、HGB逐渐减少,NEU和PLT则逐渐增多。经过14天的恢复期,各血液学指标的异常变化有所改善。结论长期给予α-MMC会引起大鼠以血细胞数量变化为主的血液学毒性变化。

苦瓜a-苦瓜素基因启动子的克隆和序列分析

以苦瓜嫩叶为试材,采用染色体步移法,克隆了α-苦瓜素基因启动子序列,并对其进行序列分析。结果表明:该启动子长1.2kb,含有2个TATA box,2个CAAT box,以及参与茉莉酸甲酯代谢、防御和压力反应、热胁迫反应、光反应调节、昼夜节律调节等的顺式作用元件。

核糖体失活蛋白(α-MC)亚细胞定位及对TMV的抑制作用

【目的】克隆获得苦瓜α-MC、商陆PAP,在烟草中异源表达观察两个蛋白在细胞中的定位情况。研究α-MC对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及其引起的抗性防御反应。【方法】根据已报道的商陆抗病毒蛋白PAP基因全序列和苦瓜素基因全序列,设计并合成扩增PAP和α-MC基因全长引物,通过RT-PCR及基因克隆方法,从苦瓜和商陆春叶克隆得到苦瓜α-MC、商陆PAP;用Wolf PSORT预测蛋白定位,将苦瓜α-MC、商陆PAP分别融合在GFP和Ds Red2的N端,构建融合蛋白表达载体,采用GFP和Ds Red2标记进行亚细胞定位,验证预测结果;通过农杆菌介导在本氏烟中瞬时表达α-MC,再接种烟草花叶病毒,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分别检测病毒在接种叶片的蛋白积累量和RNA表达量,分析瞬时表达α-MC的抗病毒效果。利用q RT-PCR分析植物防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,探究其抗病毒机理。【结果】克隆得到基因α-MC和PAP全长,分别为861和939 bp。Wolf PSORT预测显示α-MC和PAP主要定位于细胞质膜上。共聚焦荧光显微镜下观察发现,分别用GFP和Ds Red2标记的α-MC和PAP均定位在本氏烟叶片表皮细胞质膜上,与Wolf PSORT预测的α-MC和PAP定位结果相一致。异源表达的PAP对植物细胞毒性作用强,导致表达部位细胞坏死,异源表达α-MC的植物细胞无明显毒性,表达部位细胞完整。在本氏烟中异源表达α-MC后,再接种TMV-GFP,在紫外灯下观察发现α-MC处理后的本氏烟在接种TMV-GFP 48 h后没有出现绿色荧光,而对照组出现荧光。72 h后处理组出现零星荧光,但对照组的绿色荧光开始扩散,连续观察,处理组几乎没有变化,接种TMV-GFP 6 d后,发现处理组的绿色荧光几乎没有扩大的趋势,而对照组的绿色荧光已扩散至心叶;ELISA检测表明,在接种TMV-GFP 6 d后的叶片中,对照组与健康植物的OD492比值几乎已达到处理组的10倍以上;q RT-PCR检测TMV RNA的含量,结果显示对照组TMV RNA表达量是处理组的149倍左右,表明α-MC对TMV复制和移动均有明显抑制;q RT-PCR结果分析显示,NPR1在只注射TMV、单独表达α-MC以及表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均被诱导表达,但后者的表达量是前两个处理的约2.5倍左右,在只接种α-MC和表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均检测到PR1、PR2,但后者的表达量显著高出前者5—7倍,表明异源表达α-MC可诱导植物中防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,从而引起更强的防御反应。【结论】异源表达α-MC显著抑制TMV,能够激活植物防卫反应,且对植物细胞无明显毒性。研究结果为利用异源表达α-MC方法开发控制植物病毒新产品提供了参考依据。

^(125)I-α-苦瓜子蛋白的大鼠药代动力学研究

本文采用同位素示踪技术对^(125)Ⅰ-α-苦瓜子蛋白进行药代动力学研究。药物经小鼠腹腔内吸收较快,给药后2h 吸收82.3%。大鼠静脉给药后的主要药代参数T_1/2α=1.61±0.41(h),T1/2β=48.98±8.02(h),V_c=30.94±4.18(dpm/kg),K_(21)=0.084±0.032(1/h),K_(10)=0.072±0.020(1/h),K_(12)=0.23±0.08(1/h)。消除相半衰期较长,说明药物排除缓慢。药物生物利用度76.6%,提示α-苦瓜子蛋白在体内易吸收。大鼠静脉注入^(125)Ⅰ-α-苦瓜子蛋白后,血中放射性-时间数据经拟合符合二室开放动力学模型。放射性分布结果证实,最高是肾,其次为胚胎、卵巢、子宫、肝、脂肪等组织。药物主要经尿排泄,给药24h 后,排出剂量的67.3%。胆汁排泄证实此药不易形成肠肝循环。用Sephadex G-75柱层析方法证实,代谢产物仍保持原有分子大小,未被降解。

α–苦瓜素基因提高番茄对烟草花叶病毒抗性的机理研究

为了深入探究α–苦瓜素基因(αMMC)抗烟草花叶病毒(TMV)的机理,利用“番茄—TMV”互作系统,分析了αMMC转基因植株和野生型植株的生理生化参数及防御相关基因的表达。结果表明,αMMC为Ⅰ型核糖体失活蛋白,定位于细胞质;αMMC可以抑制病毒在寄主体内的繁殖,减轻番茄的病害症状,正调控番茄的防御系统。TMV侵染引起寄主体内活性氧的爆发,αMMC可以增强抗氧化酶的活性以清除活性氧,降低植物的氧化损伤,维持细胞内的氧化平衡。RT-qPCR检测结果表明,αMMC能特异性诱导防御相关基因PR1、PR4、PR6和PRB1-3的表达以提高寄主抵御TMV侵染的能力。

Alpha-momorcharin inhibits HIV-1 replication in acutely but not chronicaly infected T-lymphocytes

目的：研究α苦瓜子蛋白（αＭＭＣ）在ＨＩＶ１急性和慢性感染Ｔ淋巴细胞中的抗ＨＩＶ１活性．方法：以合胞体抑制实验，ＨＩＶ１ｐ２４核心抗原表达水平和ＨＩＶ抗原阳性细胞的百分率检测了αＭＭＣ的抗ＨＩＶ活性．结果：αＭＭＣ对ＨＩＶ１ⅢＢ诱导Ｃ８１６６细胞形成合胞体有显著的抑制作用．αＭＭＣ显著地抑制了ＨＩＶ１急性感染Ｔ细胞中ｐ２４抗原的表达水平和减少了ＨＩＶ抗原阳性细胞的百分率．在上述三种测定中，αＭＭＣ的ＥＣ５０分别是００１６，００７和０３２ｍｇ·Ｌ－１．但是，αＭＭＣ不影响慢性感染ＨＩＶ１ⅢＢ／Ｈ９中ｐ２４抗原表达水平．结论：αＭＭＣ是苦瓜子蛋白中唯一的具有抗ＨＩＶ１活性的成份．αＭＭＣ抑制急性感染中ＨＩＶ１的复制而对慢性感染Ｔ细胞中的ＨＩＶ１复制无影响．

Structure determination of glycopeptide of β-momorcharin

The structure of the N-linked oligosaccharide chain of β-momorcharin, a ribosome-inactivating protein from the seeds of Momordica charantia Linn (Cucurbitaceae), was determined. A glycopeptide liberated by pronase digestion of the glycoprotein was subjected to amino acid and neutral carbohydrate analysis to establish the composition of amino acid and sugar residues. The sequences and glycosylation hnkages of the sugar and amino acid residues in the glycopeptide were determined as Manαl-6(XyIβ1-2)-Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucαl-3)-GlcNAc-Asn-Leu by 2D-NMR spectroscopy and FAB-MS data.

聚乙二醇修饰对苦瓜核糖体失活蛋白的肝细胞毒性影响

目的探讨聚乙二醇(PEG)修饰对α型苦瓜核糖体失活蛋白(α-momorcharin,α-MMC)的大鼠肝细胞毒性的影响。方法将SD大鼠随机分为生理盐水阴性对照组,α-MMC高、中、低剂量组(蛋白含量分别为6.25、2.08、0.70mg/kg)和PEG修饰后的α-MMC-PEG高、中、低剂量组(蛋白含量相同),每组24只,隔日经尾静脉注射给药一次,连续28d,停药后恢复14d,观测动物的一般状况,并分别在给药期末和恢复期末进行肝功能和肝组织病理学检查。结果在给药第28d,与生理盐水阴性对照组比较,α-MMC高、中剂量组有明显的肝功能异常,如血清白蛋白(ALB)含量降低,血清球蛋白(GLB)增加,A/G比值降低,谷草转氨酶(AST)、总胆红素(BIL)和胆固醇(CHO)增加;HE染色可见弥散性肝细胞水肿、变性,炎性细胞浸润,甚至点状坏死。与α-MMC不同,经PEG修饰后的α-MMC-PEG各组的毒性则明显减轻,其高剂量组肝功损害指标及病理改变仅与α-MMC低剂量组接近,而中剂量和低剂量组与阴性对照组一致。结论 PEG修饰能够明显降低α-MMC对大鼠的肝细胞毒性。